Isolement et analyse fonctionnelle des mitochondries de cellules cultivées et de tissus de souris

Summary

Comparison of mitochondrial membrane potential between samples yields valuable information about cellular status. Detailed steps for isolating mitochondria and assessing response to inhibitors and uncouplers using fluorescence are described. The method and utility of this protocol are illustrated by use of a cell culture and animal model of cellular stress.

Abstract

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of cell heath due to their role in both cell metabolism and energy production as well as control of apoptosis. Therefore, direct evaluation of isolated mitochondria and mitochondrial perturbation offers the ability to determine if organelle-specific (dys)function is occurring. The methods described in this protocol include isolation of intact, functional mitochondria from HEK cultured cells and mouse liver and spinal cord, but can be easily adapted for use with other cultured cells or animal tissues. Mitochondrial function assessed by TMRE and the use of common mitochondrial uncouplers and inhibitors in conjunction with a fluorescent plate reader allow this protocol not only to be versatile and accessible to most research laboratories, but also offers high throughput.

Introduction

Les cellules vivantes Energy Bank métabolique dans la forme de graisses et d'hydrates de carbone et utilisent cette énergie pour la biosynthèse, transport membranaire et le mouvement. De l'énergie est obtenue dans le cytosol à travers la transformation des sucres alimentaires en ATP directement pendant la glycolyse. Cependant, la principale source de la production d'ATP dans une cellule est exploitée dans les mitochondries par la chaîne respiratoire mitochondriale ^1. L'architecture des mitochondries fournit l'orientation spatiale nécessaire pour la production d'ATP et efficace. Les mitochondries possèdent une double membrane séparées par un espace intermembranaire et ensemble avec la matrice, le compartiment mitochondrial plus à l'intérieur, la maison des composants et de coordonner les réactions chimiques intervenant dans la génération d'ATP. La membrane intérieure contient une série de complexes de protéines membranaires qui constituent la chaîne respiratoire ainsi que de l'ATP synthase, le complexe protéique qui réunit ADP et Pi pour la formation d'ATP. L'aubergemembrane du RE est pliée en crêtes et des électrons sont transmis le long des complexes de la chaîne respiratoire par l'intermédiaire du cytochrome c, un porteur d'électrons soluble qui se déplace entre des complexes dans l'espace intermembranaire. Comme les électrons se déplacent, l'oxydation des équivalents réducteurs se produit et des ions hydrogène sont pompés à partir de la matrice de l'espace intermembranaire. Comme conséquence de la forte concentration d'ions dans l'espace intermembranaire, un gradient électrochimique construit résultant dans un potentiel de membrane à travers la membrane mitochondriale interne (Δψ) ^2. L'oxygène est l'accepteur final d'électrons de la chaîne de transport d'électrons et des ions hydrogène se écouler à travers les ATP synthases à partir de l'espace intermembranaire revenir à la matrice, et, ce faisant directement provoquer la formation d'ATP. Ce procédé tel que décrit dans son ensemble est connu comme la phosphorylation oxydative. Les plis de la crêtes augmentent la surface de la membrane interne, ce qui permet le transport d'électrons maximale et la production d'ATP à l'intérieurchaque mitochondrie. Les protéines, des enzymes et d'autres molécules impliquées dans la phosphorylation oxydative sont dérivés de deux gènes nucléaires et mitochondriales. Les mitochondries contiennent leur propre ADN circulaire, codant pour 13 protéines, ainsi que les ARNt et les ARNm nécessaires pour la production d'ATP ^3. Cependant, beaucoup plus de protéines sont nécessaires et sont donc codées dans le noyau. La plupart de ces protéines nucléaires codés sont ciblés sur la matrice mitochondriale par l'utilisation de préséquences à l'extrémité N-terminale de la protéine précurseur, et leur importation est entraînée en partie par Δψ ^4,5.

Au-delà de la contribution aux bioénergétique d'une cellule, les mitochondries influencent également les principaux processus métaboliques telles que le TCA et le bêta-oxydation, la signalisation cellulaire par régulation de calcium, ainsi que d'un rôle clé dans l'apoptose ^6. Plus précisément, pendant les périodes de stress cellulaire, les protéines famille Bcl-2 qui résident sur ou interagissent à la membrane externe mitochondriale peut causer mitochondrialperméabilité de la membrane externe (MOMP) ^7,8. Au cours de la MOMP, le cytochrome c et d'autres protéines sont libérées dans le cytosol, et avec plusieurs protéines cytosoliques former un complexe appelé apoptosome ^9,10. Le apoptosome active caspases qui vont à cliver les protéines cellulaires et de l'ADN pendant la phase d'exécution de l'apoptose. Dès que MOMP se produit, ΔΨ est effondré et la production d'ATP arrêtée. Ainsi, la fonction mitochondriale, comme l'apoptose est déclenchée est compromise et des changements dans ΔΨ peut être corrélée à la santé cellulaire mitochondriale et ^12. Alors que l'apoptose est un critère d'évaluation dans de nombreux modèles de la maladie, la fonction mitochondriale et la modification de ΔΨ peut aussi fournir des informations précieuses sur l'origination et / ou progression de la maladie. Par exemple, des changements structurels et fonctionnels mitochondriaux ont été documentés au cours de maladies neurodégénératives ^13,14.

Dans la première partie du protocole, isolation des mitochondries intactes qui conservent leur ΔΨ est décrite. Des cellules HEK-293T ont été exposées à différentes concentrations et combinaisons de TNF-α recombinant, IL1-β et IFN-γ pour induire l'apoptose. Ces cytokines ont été choisis parce qu'ils sont fréquemment signalés à être élevée dans les échantillons primaires septiques humaines ¹⁵ et la voie extrinsèque de l'apoptose peut être déclenchée par l'interaction de se lier à son récepteur TNF-α ^6. Comme il existe des variations subtiles nécessaires pour isoler les mitochondries fonctionnelles de tissus primaires par rapport à des cellules en culture, et parce que de nombreuses recherches utilise des animaux, le protocole décrit également comment isoler les mitochondries de foie et la moelle épinière antérieure de la sclérose latérale (ALS) modèle de souris.

La seconde partie du protocole a été conçu pour contrôler des perturbations au potentiel de la membrane mitochondriale en utilisant un colorant fluorescent sensible au potentiel d'un lecteur de plaque fluorescente. Différences entre le statut cellulaire (à savoir, en bonne santé vs malsaine) se différencient par la quantification de la résistance de ΔΨ de mitochondries isolées conjointement avec des agents de découplage, des inhibiteurs de la chaîne respiratoire, des inhibiteurs et des ionophores complexes, lesquels provoquent une dissipation du potentiel de la membrane mitochondriale. La sain les mitochondries, plus le changement de ΔΨ lors d'un traitement avec des inhibiteurs mitochondriaux, par conséquent, la réponse des mitochondries peut être utilisé comme un indicateur de la fonction mitochondriale (dys).

Utilisation des mitochondries isolées plutôt que dans l'évaluation in situ de la fonction offre la preuve définitive que d'une pathologie ou de traitement module directement changements à l'organite ^16-18. Bien qu'il existe des méthodes de la littérature pour isoler les mitochondries de cellules en culture, ils sont vagues ¹⁷ et / ou utilisent de l'équipement spécialisé ^16. Ce protocole décrit en détail la méthode d'isolement et estfacilement adaptable à d'autres lignées cellulaires, y compris les tissus et les cultures primaires ^13,14,19,20. De nombreuses études de mitochondries isolées utilisent les mêmes découpleurs et inhibiteurs mitochondriaux utilisés dans ce protocole, mais avec une électrode Clark ⁽²¹ est un exemple représentatif de nombreux articles dans la littérature), qui est encore un morceau très spécifique et spécialisée de l'équipement. En outre, cette méthode traditionnelle a des limitations telles que faible débit et haute complexité ^22,23 et nécessite une quantité importante de mitochondries (~ 500 ug / réaction). Dans ce protocole, la fluorescence TMRE potentiel de membrane de la sonde de détection est utilisé en conjonction avec un lecteur de plaque fluorescente, qui est une machine standard dans de nombreux laboratoires. TMRE est largement considéré car il pénètre rapidement les cellules et les mitochondries isolées et peut être utilisé à de faibles concentrations ^24. Plusieurs réactions peuvent être rapidement mis en place en tandem et lots analysés en utilisant ce protocole. En outre, la réactions nécessitent une petite quantité beaucoup de mitochondries isolées (~ 10 pg / réaction). En exigeant moins de matériaux, échantillons de tissus ou de culture cellulaire plus petits peuvent être utilisés comme point de départ pour l'isolement de mitochondries, plusieurs répétitions ou réactions peuvent être mis en place, et assez matériel potentiellement pour d'autres expériences de mitochondries isolées telles que la production d'ATP, la consommation d'oxygène, ou l'importation les dosages sont possibles.

Protocol

Toutes les expériences animales conformes aux Instituts nationaux de la Santé et des lignes directrices ont été approuvées par l'Université Wake Forest de protection des animaux et l'utilisation Comité. Les couples reproducteurs pour SOD1G93A [B6SJL-TgN (SOD1 G93A) 1Gur] modèle de souris ont été obtenus à partir de The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). De type sauvage (WT) femelles et les mâles SOD1G93A non transgénique [B6SJL-TgN (SOD1 G93A) 1Gur] ont été élevés pour générer des souris SOD…

Representative Results

Le traitement des cellules HEK-293T avec 200 pg / ml de TNF-α, 40 ng / ml de IL1-β, et 75 ng / ml d'IFN-γ (* 3) pour 24 à 48 heures conduit à des quantités progressives de la mort cellulaire (Figure 1A ). La viabilité cellulaire a été évaluée en utilisant des dosages MTT et démontre qu'il existe toujours ~ diminution de 10% de la viabilité cellulaire à un traitement de 24 heures et environ 20% de diminution de traitement 48 h. Les cellules traitées avec des concentrations similair…

Discussion

Le traitement des cellules HEK-293T avec les cytokines recombinantes provoque des quantités modérées de la mort cellulaire de plus de 48 h (Figure 1). La quantité de la mort cellulaire induite par TNF-alpha traitement est similaire aux études précédemment rapportées ³⁰ et la viabilité cellulaire diminue après co-administration de multiples cytokines qui sont supérieures à des quantités sommatives avec toute cytokine seule est également conforme à la littérature ^{31,32.</su…}

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
L-glutamic acid	Sigma	G1251	Can use the potassium salt instead.
malic acid	Sigma	M8304	Can use the potassium salt instead.
KH2PO4	Sigma	P0662
K2HPO4	Sigma	P3786
EGTA	Sigma	E3889
Trisma base	Sigma	T6066
MOPS	Sigma	M3183
CCCP	Sigma	C2920	Dilute down to 100uM as a working stock in ethanol and store at -20C.
Valinomycin	Sigma	V0627	Make in DMSO and use as a 5uM working stock. Store at -20C.
sucrose	Fisher	S5-500
KCN	Mallinckrodt	6379	Make a concentrated stock in ethanol and then dilute with water
rotenone	Sigma	R8875	Highly toxic. Made in ethanol.
oligomycin	Sigma	O4876	Highly toxic. Made in ethanol.
ADP	Sigma	A2754
TMRE	Sigma	8717-25mg	Dilute 100uM stock with EB immediatley before use.
DMEM	Gibco	11965-084	1x regular (high glucose).
Pen/Strep	Invitrogen	15140-155
L-glutamine	Fisher	SH3002101	Store aliquots at -20C
FBS	Lonza	14-501F	US origin, premium quality. Heat inactivate and store aliquots at -20
Trypsin-EDTA	Sigma	T4049
DMSO	SIgma	D2650
Protien Assay Dye (5x)	Bio-Rad	500-0006	Any protein assay can substitute.
BSA	Fisher	BP1600-100	Make 2mg/mL stock in water for protein assay.
MTT powder	Sigma	M2128	Filter sterlize 5mg/mL stock made in PBS. Store aliquots at -20C; store at 4C for up to 1 week.
Tergitol solution (NP-40)	Sigma	NP40S
Recombinant Human IL-1B	Gibco	PCH08014	Once opened store aliquots at -20C
Recombinant Human TNF-alpha	Gibco	PHC3015L
Recombinant Human IFN-gamma	Gibco	PHC4031
Dulbeccos PBS (-/-)	Sigma	D8537	Make sure it is without Mg2+ and Ca2+ ions.
Cytochrom c ELISA kit	R&D systems	DTC0	Human for HEK-293T cells.