Visualisering Non-lytisk eksocytose av<em> Cryptococcus neoformans</em> Fra Makrofager Bruke Digital Light Mikros

Summary

Vi beskriver hvordan du kan visualisere macrophage- C. neoformans (CN) interaksjoner i sanntid, med spesiell vekt på prosessen med ikke-lytisk eksocytose bruker digital lysmikroskopi. Ved hjelp av denne teknikken individuelt infiserte makrofager kan studeres for å fastslå ulike aspekter av dette fenomenet.

Abstract

Mange aspekter ved infeksjon av makrofager av Cryptococcus neoformans har blitt grundig studert og godt definert. Men en spesiell interaksjon som ikke er klart forstått er ikke-lytisk eksocytose. I denne prosessen, er gjærceller slippes ut i det ekstracellulære rom av en dårlig forstått mekanisme som forlater både makrofag og Cn levedyktige. Her beskriver vi hvordan å følge et stort antall individuelt infiserte makrofager etter en 24-timers periode ved infeksjon av tidsforskjøvede mikroskopi. Infiserte makrofager er plassert i et varmekammer med en atmosfære av CO ₂ festet til et mikroskop som gir de samme betingelser som et cellekulturinkubator. Direktesendt digital mikroskopi kan gi informasjon om de dynamiske samspillet mellom vert og patogen som ikke er tilgjengelig fra statiske bilder. Å være i stand til å visualisere hver infisert celle kan gi ledetråder for hvordan makrofager behandle soppinfeksjoner, og vice versa. Denne teknikken jegSA kraftig verktøy i å studere dynamikken som er bak et komplekst fenomen.

Introduction

Stadier av en soppinfeksjon mellom cryptococcal celler og makrofager er godt dokumentert ^1-3. Etter at gjærcellene er inntatt av makrofager, kan en rekke interaksjoner oppstår: the macrophage kan lyserer avgi sin sopp belastning inn i det ekstracellulære rom, eller det kan kontrollere infeksjonen ved å holde gjærcellene innenfor rammen av den cellulære membran ^4. Imidlertid, for mange år siden en ny utfall ble beskrevet uavhengig av to grupper: ikke-lytisk exocytose, en prosess hvori en makrofag kalles noen eller alle av de cryptococcal cellene inn i det omkringliggende miljø, eller en nærliggende celle, og både vert og patogen forblir levedyktige ^{5 -8.} Flere studier har forsøkt å forstå de molekylære mekanismene bak denne interaksjonen, men vi fortsatt ikke har en full forståelse på hva som driver dette fenomenet.

Muligheten til å ta bilder i sanntid og deretter senere analysere flere infisereed makrofager gjør det mulig å svare på mange spørsmål om de fysiske egenskapene omkringliggende ikke-lytisk eksocytose i forhold til timing, romlig kapasitet, endring i morfologi og selv stresset av makrofager under en soppinfeksjon. Ved å la cellene til å bli plassert i et miljø som er sammenlignbar med en inkubator, kan vi skimte den dynamiske natur makrofag-sopp celle interaksjoner. Forskere har brukt denne teknikken for å studere ulike komponentene i denne prosessen. Rollen til phagosome i denne prosessen ble gjort tydelig ved hjelp av fluorescerende farging og aktin blokkere ^9, mens en annen gruppe brukte denne metoden for å vise at ikke-lytisk eksocytose ble blokkert i celler som har hatt vaskekjernedannelses protein domener slettet ^10. Effekten av cytokin-signalering er også blitt fastslått ved hjelp av ^sanntids-11 mikroskopi. Denne prosessen er ikke begrenset til C. neoformans som det har også blitt observert med Candida albicans, another sopp patogen som har evnen til å infisere makrofager ^12. Disse funnene er eksempler på hvordan denne metoden kan gi et vell av informasjon til et område vi vet så lite om.

Protocol

Alle dyr arbeidet ble gjort i samsvar med forskrifter og retningslinjer fra Institute for Animal studier ved Albert Einstein College of Medicine. 1. Vekstvilkår C. neoformans H99 (serotype A) Grow enkelte C. neoformans (CN) kolonier på SABOURAUD agar plater. En dag før eksperimentet, velger du en koloni og vaksinere 10 ml Sabouraud buljong. Tillat kulturen å vokse over natten ved 37 ° C risting ved en hastighet på 250 rpm. <p c…

Representative Results

Bildene at denne teknikken produserer kan analyseres på en rekke måter for å samle inn informasjon som omgir hva som skjer etter at cellene har phagocytosed C. neoformans. Som sett i figur 1, er det omtrent 100 makrofager som enten er infisert eller ikke-infisert. Hver og en av disse makrofager gir seeren en mulighet til å studere verts-patogen interaksjoner på en meget mikroskopisk nivå. Som figur 2 og 3 viser, er det ulike utfall som kan oppstå mellom …

Discussion

Her har vi beskrevet en metode der sopp-makrofag interaksjoner kan registreres og analyseres i sanntid over en 24 timers periode. Laboratoriet har brukt denne protokollen til å studere mange av de timelige aspekter av ikke-lytisk eksocytose og vil fortsette å bruke sanntid mikroskopi for å fastslå morfologiske komponenter som omgir denne prosessen.

For denne teknikken til å gi ideelle resultater, bør det tas særlig hensyn til visse skritt i protokollen. Celletettheten som er belagt kv…

Materials

Sabouraud Dextrose Agar	BD	DF0109-17-1
Sabouraud Dextrose Broth	BD	DF0382-17-9
Dubelcco's Modified Eagle's Medium(DMEM)	Corning Cellgro	10-013-CV
Fetal Calf Serum ( FCS)	Atlanta Biologicals	S12450
NCTC 109	Invitrogen	21340-039
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-122
HEPES Buffer	Corning Cellgro	25-060-Cl
Glutamax	Invitrogen	35050-061
Non-essential Amino Acids	Corning Cellgro	25-025-Cl
2-Mercaptoethanol	Invitrogen	21985-023	Toxic
3003 Tissue Culture Petri Dishes	Fisher Scientific	08772E
CellStripper	Corning Cellgro	25-056-Cl
Mat-tek Glass Bottom Culture Dishes	MatTek	P35GC-1.5-14-C
LPS	Sigma	L3137
Mouse IFN-g	Roche	NC 9222016
mAb 18B7	Non-commerical antibody produced in our lab
Axiovert 200M Microscope with Incubating Chamber	Zeiss