Transcriptional विश्लेषण के लिए बड़े पैमाने पर Zebrafish भ्रूण दिल विच्छेदन
Summary
Zebrafish दिल के विकास के दौरान हृदय जीन की अभिव्यक्ति प्रोफाइल का विश्लेषण करने के लिए, कुल शाही सेना पृथक दिल से निकाला जा चुका है। यहाँ, हम हृदय-विशिष्ट mRNA के प्राप्त करने के लिए zebrafish भ्रूण से तेजी से मार्गदर्शन विच्छेदन द्वारा कार्यात्मक / पिटाई दिलों इकट्ठा करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं।
Abstract
zebrafish भ्रूण दिल पूरे भ्रूण का केवल एक छोटा सा अंश का प्रतिनिधित्व केवल कुछ सौ कोशिकाओं से बना है। इसलिए, वैश्विक भ्रूण transcriptome नकाबपोश द्वारा किया जा रहा से हृदय transcriptome को रोकने के लिए, यह आगे विश्लेषण के लिए दिल की पर्याप्त संख्या इकट्ठा करने के लिए आवश्यक है। Zebrafish हृदय विकास तेजी से आय के रूप में इसके अलावा, दिल के संग्रह और शाही सेना निकासी तरीकों नमूनों की एकरूपता सुनिश्चित करने के क्रम में जल्दी करने की जरूरत है। यहाँ, हम zebrafish भ्रूण से कार्यात्मक / पिटाई दिलों इकट्ठा करने के लिए एक तेजी से मार्गदर्शन विच्छेदन प्रोटोकॉल उपस्थित थे। इस transcriptome विश्लेषण करती द्वारा इस तरह के मात्रात्मक वास्तविक समय पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (आरटी-qPCR) के रूप में, हृदय-विशिष्ट जीन की अभिव्यक्ति का स्तर निर्धारित करने के लिए बाद में हृदय-विशिष्ट शाही सेना निकासी के लिए एक अनिवार्य शर्त है। विधि अन्य ऊतकों के साथ तुलना में zebrafish भ्रूण दिल का अंतर चिपकने वाला गुणों के आधार पर किया जाता है; इस तेजी से बनावट के लिए अनुमति देता हैfluidic कतरनी बल व्यवधान, stepwise निस्पंदन और ट्रांसजेनिक fluorescently लेबल दिलों का मार्गदर्शन संग्रह का एक संयोजन द्वारा extracardiac ऊतक से हृदय की सिसल जुदाई।
Introduction
जेबराफिश (देनियो rerio) व्यापक रूप से की वजह से छोटे आकार और फ्लोरोसेंट प्रोटीन के ऊतक विशेष अभिव्यक्ति के साथ ट्रांसजेनिक संवाददाता लाइनों की उपलब्धता के साथ संयुक्त अपनी तेजी से, पारदर्शी और extrauterine भ्रूण विकास के लिए vivo में जीवोत्पत्ति के अध्ययन करने के लिए विकासात्मक जीव विज्ञान में प्रयोग किया जाता है। इस छोटे से कशेरुकी विशेष रूप से अच्छी तरह से जल्दी zebrafish भ्रूण की oxygenation दिल की धड़कन और रक्त के प्रवाह पर निर्भर नहीं करता है, क्योंकि दिल विकास का अध्ययन करने के लिए अनुकूल है; इन सुविधाओं के हृदय म्यूटेंट 1,2 की बड़ी संख्या के लक्षण वर्णन की अनुमति दी है और zebrafish अब हृदय रोगों तीन अध्ययन करने के लिए एक व्यापक रूप से मान्यता प्राप्त मॉडल जीव है।
भ्रूण के विकास के दौरान जीन की अभिव्यक्ति का अध्ययन करने के लिए, टेप सामान्यतः पूरे माउंट स्वस्थानी संकरण में (इच्छा) 4 से विश्लेषण कर रहे हैं, आरटी-qPCR के 5, प्रोटीन 6, या अगली पीढ़ी के अनुक्रमण (आरएनए Seq) 7। जबकिइच्छा पूरी भ्रूण के भीतर जीन अभिव्यक्ति का एक स्थानिक-लौकिक विश्लेषण, प्रतिलेख के स्तर आमतौर पर आर टी-qPCR, प्रोटीन या शाही सेना Seq दृष्टिकोण से मूल्यांकन कर रहे हैं अनुमति देता है। हालांकि, इन तरीकों विशिष्ट जीन अभिव्यक्ति की रूपरेखा के लिए ऊतक संवर्धन की आवश्यकता होती है।
Zebrafish भ्रूण दिल पूरे भ्रूण का एक छोटा सा अंश का प्रतिनिधित्व करता है के बाद से, हृदय विकास के दौरान transcriptome पढ़ाई विच्छेदन और दिल के संवर्धन के लिए एक प्रोटोकॉल की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, physiologically प्रासंगिक डेटा प्राप्त करने के लिए, यह शाही सेना निकासी जब तक पूरी तरह कार्यात्मक हृदय के ऊतकों को बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है। यहाँ, हम तेजी से physiologically सामान्य अलग और कुशलता से आगे के विश्लेषण के लिए उच्च गुणवत्ता शाही सेना के नमूने प्राप्त करने के लिए zebrafish भ्रूण के सैकड़ों से दिल की धड़कन के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन है। वर्तमान विधि बर्न्स और मॅकरै, 2006 8 द्वारा रिपोर्ट प्रोटोकॉल पर आधारित है। हृदय के ऊतकों के संवर्धन के लिए, दोनों तरीकों एक ट्रांसजेनिक दौरे संवाददाता लाइन का उपयोगऔर अन्य ऊतकों बनाम zebrafish भ्रूण दिल का अंतर आसंजन गुण का लाभ ले। संक्षेप में, एक संकीर्ण विंदुक टिप के माध्यम से ऊपर और नीचे कई भ्रूण pipetting द्वारा, दिल एक साथ भ्रूण निकायों से जारी किया जाता है और बाद में दो तेजी से छानने का काम चरणों में भ्रूण मलबे से अलग; fluorescently लेबल दिल तो स्वयं शेष मलबे से हल और आगे की प्रक्रिया के लिए एकत्र कर रहे हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल के जीन की अभिव्यक्ति के लिए zebrafish भ्रूण हृदय के ऊतकों का तेजी संवर्धन का विश्लेषण करती है की अनुमति देता है। आरएनए शुद्धि ही पर्याप्त के साथ काम करेंगे के बाद से, दिल की हानि प्रोटोकॉल के हर क…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank C. Burns, C. McRae for outlining the basic principle of this purification protocol, and F. Priller for initial implementation of this method in our lab. S.A.-S. is supported by a Heisenberg professorship of the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG). This work was supported by DFG grant SE2016/7-1.
Materials
| Equipment for raising fish and collecting eggs | see the Zebrafish Book11 for details | ||
| Fluorescence stereomicroscope | |||
| Refrigerated Microcentrifuge | |||
| UV-Spectrophotometer | eg. Thermo Scientific Nanodrop 2000 | ||
| Nucleic acid electrophoresis chamber | |||
| Petri dishes 4cm Ø, coated with 1% agarose in E3 medium | |||
| Micropipettes and tips (P20, P100, P1000) | |||
| 1,5ml centrifugation tubes | |||
| 15ml and 50ml centrifugation tubes | |||
| Pair of Dumont #5 forceps | |||
| ExactaCruz™ Round Gel Loading Tips in Sterile Rack, 1-200μl | Santa Cruz | sc-201732 | |
| 100 μm filter (BD Falcon 100 mm Cell Strainer) | BD Biosciences | 352360 | |
| 30 μm filter (Pre-Separation Filters-30 µm) | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | |
| Phase lock gel, heavy, 1,5ml tubes | Prime | 2302810 | |
| Egg water medium | 60μg/ml Instant Ocean Sea Salts in ddH2O, 0.00001% (w/v) Methylene Blue | ||
| E3 medium | 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4 | ||
| Tricaine (3-amino benzoic acidethylester) | Sigma-Aldrich | A-5040 | 4mg/ml Tricaine stock solution, pH 7 |
| 1% agarose (in E3 medium) | |||
| 1% agarose gel (in TBE buffer) | |||
| Leibovitz´s L-15 medium | Gibco | 21083-027 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Sigma | F4135 | |
| RNAlater | Ambion | AM7020 | |
| Trizol | Ambion | 1559606 | |
| Glycogen | Invitrogen | 10814-010 | 20 µg/µL in RNase-free water |
| chloroform | |||
| isopropanol | |||
| 75% ethanol (in DEPC-ddH2O) | |||
| Nuclease-free water or sterilized DEPC treated ddH2O | |||
| Nucleic acid loading buffer | |||
| TBE (Tris/Borate/EDTA) buffer for electrophoresis |
References
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