Крупномасштабные данио рерио эмбриональных Сердце Вскрытие для транскрипционных анализа
Summary
Для анализа профилей экспрессии генов сердечных во данио развития сердца, общей РНК должны быть извлечены из изолированных сердцах. Здесь мы приводим протокол для сбора функционал / бьющееся сердце быстрым ручной вскрытия из эмбрионов данио рерио, чтобы получить сердечно-специфической мРНК.
Abstract
Данио рерио эмбриональных сердце состоит только из нескольких сотен клеток, что составляет лишь небольшую часть всей эмбриона. Поэтому, чтобы предотвратить сердечный транскриптом от маскируется глобальной эмбрионального транскриптома, необходимо собрать достаточное количество сердец для дальнейшего анализа. Кроме того, как данио сердца развитие протекает быстро, сбор сердца и методы экстракции РНК должны быть быстрым, чтобы обеспечить однородность образцов. Здесь мы представляем быстрый ручной протокол вскрытия для сбора функционал / бьющееся сердце из эмбрионов данио рерио. Это является необходимым условием для последующего извлечения сердца РНК с определения сердечно-определенные уровни экспрессии генов с транскриптомный анализы, такие как количественное ПЦР в реальном времени (RT-КПЦР). Метод основан на дифференциальных адгезивных свойств данио эмбрионального сердца по сравнению с другими тканями; Это позволяет быстро PHYSical разделение сердечной ткани от экстракардиальной сочетанием текучей нарушения силы сдвига, ступенчатой фильтрации и ручного сбора трансгенных флуоресцентно меченных сердца.
Introduction
Данио рерио (Danio rerio) широко используется в биологии развития для изучения органогенеза в естественных условиях из-за его быстрого, прозрачного и внематочной эмбрионального развития, в сочетании с малым размером и наличием трансгенных репортеров линий с тканевой экспрессией флуоресцентных белков. Этот небольшой позвоночных особенно хорошо подходит для изучения развития сердца, потому что оксигенации начале данио эмбриона не зависит от сердечного ритма и потока крови; Эти особенности позволили охарактеризовать большого числа сердечно-сосудистых мутантов 1,2 и данио сейчас широко признается модельным организмом для изучения сердечных заболеваний 3.
Для изучения экспрессии генов в ходе эмбрионального развития, стенограммы, как правило, анализируется целом монтажа в гибридизация (желанию) 4, RT-КПЦР 5, микрочипы 6, или следующего поколения секвенирования (RNA-Seq) 7. В то время какWISH позволяет пространственно-временной анализ экспрессии генов в пределах всего эмбриона, уровни транскриптов, как правило, оценивали с помощью RT-количественной ПЦР, микрочипов, или РНК-Seq подходов. Однако эти способы требуют обогащения тканей для конкретного профилирования экспрессии генов.
С данио эмбриональных сердце представляет собой небольшую долю всего эмбриона, транскриптом исследования во время развития сердца требуют протокол вскрытия и обогащения сердец. Кроме того, для получения физиологически релевантных данных, важно поддерживать сердечную ткань полностью функциональный до экстракции РНК. Здесь мы опишем протокол для быстрого выделения физиологически нормальным и избиения сердца сотен эмбрионов данио эффективно получить образцы РНК высокого качества для дальнейшего анализа. Данный способ основан на протоколе сообщалось Бернсом и MacRae, 2006 8. Для обогащения сердечной ткани, оба метода используют трансгенное миокарда репортер линиии воспользоваться дифференциальных адгезионные свойства данио эмбриональных сердцах по сравнению с другими тканями. Вкратце, с помощью пипетки много эмбрионов вверх и вниз через узкий кончик пипетки, сердца одновременно выпустили из эмбриональных органов, а затем отделяется от эмбриональной мусора в два этапа быстрой фильтрации; флуоресцентно меченных сердца вручную сортируются от оставшегося мусора и собирают дл дальнейшей обработки.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол позволяет быстрое обогащение данио эмбриональных тканей сердца для экспрессии гена анализа. Количество и качество сердечно-конкретного образца РНК во многом зависит от нескольких важных этапов: во-первых, количество образца значительно улучшено, если потеря сердца пре?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank C. Burns, C. McRae for outlining the basic principle of this purification protocol, and F. Priller for initial implementation of this method in our lab. S.A.-S. is supported by a Heisenberg professorship of the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG). This work was supported by DFG grant SE2016/7-1.
Materials
| Equipment for raising fish and collecting eggs | see the Zebrafish Book11 for details | ||
| Fluorescence stereomicroscope | |||
| Refrigerated Microcentrifuge | |||
| UV-Spectrophotometer | eg. Thermo Scientific Nanodrop 2000 | ||
| Nucleic acid electrophoresis chamber | |||
| Petri dishes 4cm Ø, coated with 1% agarose in E3 medium | |||
| Micropipettes and tips (P20, P100, P1000) | |||
| 1,5ml centrifugation tubes | |||
| 15ml and 50ml centrifugation tubes | |||
| Pair of Dumont #5 forceps | |||
| ExactaCruz™ Round Gel Loading Tips in Sterile Rack, 1-200μl | Santa Cruz | sc-201732 | |
| 100 μm filter (BD Falcon 100 mm Cell Strainer) | BD Biosciences | 352360 | |
| 30 μm filter (Pre-Separation Filters-30 µm) | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | |
| Phase lock gel, heavy, 1,5ml tubes | Prime | 2302810 | |
| Egg water medium | 60μg/ml Instant Ocean Sea Salts in ddH2O, 0.00001% (w/v) Methylene Blue | ||
| E3 medium | 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4 | ||
| Tricaine (3-amino benzoic acidethylester) | Sigma-Aldrich | A-5040 | 4mg/ml Tricaine stock solution, pH 7 |
| 1% agarose (in E3 medium) | |||
| 1% agarose gel (in TBE buffer) | |||
| Leibovitz´s L-15 medium | Gibco | 21083-027 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Sigma | F4135 | |
| RNAlater | Ambion | AM7020 | |
| Trizol | Ambion | 1559606 | |
| Glycogen | Invitrogen | 10814-010 | 20 µg/µL in RNase-free water |
| chloroform | |||
| isopropanol | |||
| 75% ethanol (in DEPC-ddH2O) | |||
| Nuclease-free water or sterilized DEPC treated ddH2O | |||
| Nucleic acid loading buffer | |||
| TBE (Tris/Borate/EDTA) buffer for electrophoresis |
References
- Stainier, D. Y., et al. Mutations affecting the formation and function of the cardiovascular system in the zebrafish embryo. Development. 123, 285-292 (1996).
- Chen, J. N., et al. Mutations affecting the cardiovascular system and other internal organs in zebrafish. Development. 123, 293-302 (1996).
- Bakkers, J. Zebrafish as a model to study cardiac development and human cardiac disease. Cardiovasc Res. 91, 279-288 (2011).
- Jowett, T., Lettice, L. Whole-mount in situ hybridizations on zebrafish embryos using a mixture of digoxigenin- and fluorescein-labelled probes. Trends Genet. 10, 73-74 (1994).
- Gibson, U. E., Heid, C. A., Williams, P. M. A novel method for real time quantitative RT-PCR. Genome Res. 6, 995-1001 (1996).
- Epstein, C. B., Butow, R. A. Microarray technology – enhanced versatility, persistent challenge. Curr Opin Biotechnol. 11, 36-41 (2000).
- Qian, X., Ba, Y., Zhuang, Q., Zhong, G. RNA-Seq Technology and Its Application in Fish Transcriptomics. OMICS. 18, 98-110 (2014).
- Burns, C. G., MacRae, C. A. Purification of hearts from zebrafish embryos. Biotechniques. 40, 274-278 (2006).
- Huang, C. J., Tu, C. T., Hsiao, C. D., Hsieh, F. J., Tsai, H. J. Germ-line transmission of a myocardium-specific GFP transgene reveals critical regulatory elements in the cardiac myosin light chain 2 promoter of zebrafish. Dev Dyn. 228, 30-40 (2003).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).
- Westerfield, M. . The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).
- Veerkamp, J., et al. Unilateral dampening of Bmp activity by nodal generates cardiac left-right asymmetry). Dev Cell. 24, 660-667 (2013).
- Jin, S. W., Beis, D., Mitchell, T., Chen, J. N., Stainier, D. Y. Cellular and molecular analyses of vascular tube and lumen formation in zebrafish. Development. 132, 5199-5209 (2005).
- Brownlie, A., et al. Characterization of embryonic globin genes of the zebrafish. Dev Biol. 255, 48-61 (2003).
- Marvin, M., et al. Developmental expression patterns of the zebrafish small heat shock proteins. Dev Dyn. 237, 454-463 (2008).
- Lam, C. S., Marz, M., Strahle, U. gfap and nestin reporter lines reveal characteristics of neural progenitors in the adult zebrafish brain. Dev Dyn. 238, 475-486 (2009).
- Wang, Y., et al. Moesin1 and Ve-cadherin are required in endothelial cells during in vivo tubulogenesis. Development. 137, 3119-3128 (2010).
- Heiman, M., et al. A translational profiling approach for the molecular characterization of CNS cell types. Cell. 135, 738-748 (2008).
- Tryon, R. C., Pisat, N., Johnson, S. L., Dougherty, J. D. Development of translating ribosome affinity purification for zebrafish. Genesis. 51, 187-192 (2013).
