Transkripsiyonal Analiz Büyük ölçekli Zebra balığı Embriyonik Kalp Diseksiyon
Summary
Zebra balığı kalp gelişimi sırasında kalp gen ekspresyon profillerini analiz etmek, toplam RNA izole kalpleri elde edilecek olan. Burada, biz kalp-özel mRNA elde etmek Zebra balığı embriyolarının gelen hızlı manuel diseksiyon ile işlevsel / yenerek kalpleri toplamak için bir protokol mevcut.
Abstract
Zebra balığı Embriyonik kalp tüm embriyonun sadece küçük bir kısmını temsil eden, sadece birkaç yüz hücrelerden oluşur. Bu nedenle, genel embriyonik transcriptome tarafından maskelenen kardiyak transcriptome önlemek için, ayrıca analiz için kalpleri yeterli sayıda toplamak için gereklidir. Zebra balığı kalp geliştirme hızla devam Dahası, kalp toplanması ve RNA ekstraksiyonu yöntemleri numunelerin homojen olmasını sağlamak için hızlı olması gerekir. Burada, biz Zebra balığı embriyolarının fonksiyonel / yenerek kalpleri toplamak için hızlı manuel diseksiyon protokolü sunuyoruz. Bu transcriptome analizleri ile bu kantitatif gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (RT-qPCR) halinde, kalp-özgü gen ekspresyon seviyelerini belirlemek için daha sonra, kalp-özel RNA ekstraksiyonu için bir temel oluşturur. yöntem, diğer dokulara göre zebra balığı embriyonik kalp diferansiyel yapışma özellikleri dayanmaktadır; Bu hızlı laşılmakla sağlarakışkan kesme kuvveti bozulması, aşamalı filtrasyon ve transgenik floresan etiketli kalplerin manuel toplama bir kombinasyonu ile dışı dokusundan kalp ceği ayrılması.
Introduction
Balığı (Danio rerio), yaygın küçük olması nedeniyle ve floresan proteinleri dokuya-özel ifadesi transjenik raportör hatları durumu ile birleştirilmiş olan, hızlı, şeffaf ve rahim dışı embriyonik gelişme, in vivo olarak organogenez çalışma gelişim biyolojisi kullanılır. Bu küçük omurgalı, özellikle de erken Zebra balığı embriyonun oksijenlenme, kalp atışı ve kan akımı dayanmaz çünkü kalp gelişimini incelemek için uygundur; Bu özellikler kardiyovasküler mutantların 1,2 sayıda karakterizasyonu izin ve zebra balığı artık kalp hastalıkları 3 incelemek için yaygın olarak tanınan bir model organizmadır.
Embriyo gelişimi esnasında gen ekspresyonunu incelemek için, transkriptler genellikle tüm montaj in situ melezleşme (VVISH) 4 ile analiz edilmiştir, RT-qPCR 5, mikrodiziler 6, ya da bir sonraki nesil sıralama (RNA Dizi) 7. SüreWISH analiz tüm embriyo olan gen ifadesinin uzamsal ve zamansal analizi, transkript seviyeleri, genellikle, RT-qPCR mikrodizilerdeki ya da RNA-Seq yaklaşımlarla değerlendirilir sağlar. Bununla birlikte, bu yöntemler, belirli bir gen ekspresyonu profillemesi doku zenginleştirme gerektirir.
Zebra balığı Embriyonik kalp tüm embriyo küçük bir kısmını temsil ettiğinden dolayı, kalp gelişimi sırasında transcriptome çalışmaları diseksiyon ve kalpleri zenginleştirilmesi için bir protokol gerektirir. Buna ek olarak, fizyolojik olarak ilgili veri elde etmek için, bu RNA ekstraksiyonu kadar tam olarak işlevsel kalp dokusunu muhafaza etmek önemlidir. Burada, biz hızla fizyolojik, normal izole ve verimli bir şekilde ileri analizler için yüksek kaliteli RNA örnekleri elde etmek için Zebra balığı embriyolarının yüzlerce kalpleri yenerek bir protokol açıklar. Bu yöntem Burns ve MACRAE 2006 8 tarafından bildirilen protokol dayanmaktadır. Kalp dokusunun zenginleşmesi için, her iki yöntem bir transgenik miyokard muhabiri hattını kullanmakve diğer dokulara karşı Zebra balığı embriyonik kalpleri diferansiyel yapışma özelliklerine yararlanmak. Kısaca, dar bir pipet ucu ile yukarı ve aşağı doğru çok sayıda embriyolar pipetleme, kalpler aynı embriyonik gövdelerinden serbest bırakılır ve daha sonra, iki hızlı bir filtreleme adımlarından embriyonik enkaz ayrılır; floresan etiketli kalpler sonra el kalan enkaz sıralanır ve daha fazla işlem için toplanır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol gen ifadesi için Zebra balığı Embriyonik kalp dokusunun hızlı zenginleşme analizleri verir. RNA arıtma sadece yeterli çalışır çünkü, kalplerin kaybı protokolü her aşamasında önlenir, ilk numune miktarı büyük ölçüde artırıldı: kardiyak spesifik RNA örnek miktarı ve kalitesi büyük ölçüde bir kaç önemli adımlar bağlıdır başlangıç malzemesi. İkinci olarak, deneyi ile tamamen bağlıdır numune saflığı, sıralama ve sıkı bir şekilde diğer dokuları hariç…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank C. Burns, C. McRae for outlining the basic principle of this purification protocol, and F. Priller for initial implementation of this method in our lab. S.A.-S. is supported by a Heisenberg professorship of the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG). This work was supported by DFG grant SE2016/7-1.
Materials
| Equipment for raising fish and collecting eggs | see the Zebrafish Book11 for details | ||
| Fluorescence stereomicroscope | |||
| Refrigerated Microcentrifuge | |||
| UV-Spectrophotometer | eg. Thermo Scientific Nanodrop 2000 | ||
| Nucleic acid electrophoresis chamber | |||
| Petri dishes 4cm Ø, coated with 1% agarose in E3 medium | |||
| Micropipettes and tips (P20, P100, P1000) | |||
| 1,5ml centrifugation tubes | |||
| 15ml and 50ml centrifugation tubes | |||
| Pair of Dumont #5 forceps | |||
| ExactaCruz™ Round Gel Loading Tips in Sterile Rack, 1-200μl | Santa Cruz | sc-201732 | |
| 100 μm filter (BD Falcon 100 mm Cell Strainer) | BD Biosciences | 352360 | |
| 30 μm filter (Pre-Separation Filters-30 µm) | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | |
| Phase lock gel, heavy, 1,5ml tubes | Prime | 2302810 | |
| Egg water medium | 60μg/ml Instant Ocean Sea Salts in ddH2O, 0.00001% (w/v) Methylene Blue | ||
| E3 medium | 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4 | ||
| Tricaine (3-amino benzoic acidethylester) | Sigma-Aldrich | A-5040 | 4mg/ml Tricaine stock solution, pH 7 |
| 1% agarose (in E3 medium) | |||
| 1% agarose gel (in TBE buffer) | |||
| Leibovitz´s L-15 medium | Gibco | 21083-027 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Sigma | F4135 | |
| RNAlater | Ambion | AM7020 | |
| Trizol | Ambion | 1559606 | |
| Glycogen | Invitrogen | 10814-010 | 20 µg/µL in RNase-free water |
| chloroform | |||
| isopropanol | |||
| 75% ethanol (in DEPC-ddH2O) | |||
| Nuclease-free water or sterilized DEPC treated ddH2O | |||
| Nucleic acid loading buffer | |||
| TBE (Tris/Borate/EDTA) buffer for electrophoresis |
References
- Stainier, D. Y., et al. Mutations affecting the formation and function of the cardiovascular system in the zebrafish embryo. Development. 123, 285-292 (1996).
- Chen, J. N., et al. Mutations affecting the cardiovascular system and other internal organs in zebrafish. Development. 123, 293-302 (1996).
- Bakkers, J. Zebrafish as a model to study cardiac development and human cardiac disease. Cardiovasc Res. 91, 279-288 (2011).
- Jowett, T., Lettice, L. Whole-mount in situ hybridizations on zebrafish embryos using a mixture of digoxigenin- and fluorescein-labelled probes. Trends Genet. 10, 73-74 (1994).
- Gibson, U. E., Heid, C. A., Williams, P. M. A novel method for real time quantitative RT-PCR. Genome Res. 6, 995-1001 (1996).
- Epstein, C. B., Butow, R. A. Microarray technology – enhanced versatility, persistent challenge. Curr Opin Biotechnol. 11, 36-41 (2000).
- Qian, X., Ba, Y., Zhuang, Q., Zhong, G. RNA-Seq Technology and Its Application in Fish Transcriptomics. OMICS. 18, 98-110 (2014).
- Burns, C. G., MacRae, C. A. Purification of hearts from zebrafish embryos. Biotechniques. 40, 274-278 (2006).
- Huang, C. J., Tu, C. T., Hsiao, C. D., Hsieh, F. J., Tsai, H. J. Germ-line transmission of a myocardium-specific GFP transgene reveals critical regulatory elements in the cardiac myosin light chain 2 promoter of zebrafish. Dev Dyn. 228, 30-40 (2003).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).
- Westerfield, M. . The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).
- Veerkamp, J., et al. Unilateral dampening of Bmp activity by nodal generates cardiac left-right asymmetry). Dev Cell. 24, 660-667 (2013).
- Jin, S. W., Beis, D., Mitchell, T., Chen, J. N., Stainier, D. Y. Cellular and molecular analyses of vascular tube and lumen formation in zebrafish. Development. 132, 5199-5209 (2005).
- Brownlie, A., et al. Characterization of embryonic globin genes of the zebrafish. Dev Biol. 255, 48-61 (2003).
- Marvin, M., et al. Developmental expression patterns of the zebrafish small heat shock proteins. Dev Dyn. 237, 454-463 (2008).
- Lam, C. S., Marz, M., Strahle, U. gfap and nestin reporter lines reveal characteristics of neural progenitors in the adult zebrafish brain. Dev Dyn. 238, 475-486 (2009).
- Wang, Y., et al. Moesin1 and Ve-cadherin are required in endothelial cells during in vivo tubulogenesis. Development. 137, 3119-3128 (2010).
- Heiman, M., et al. A translational profiling approach for the molecular characterization of CNS cell types. Cell. 135, 738-748 (2008).
- Tryon, R. C., Pisat, N., Johnson, S. L., Dougherty, J. D. Development of translating ribosome affinity purification for zebrafish. Genesis. 51, 187-192 (2013).
