Mycket effektiv Ligering av små RNA-molekyler för MicroRNA Kvantifiering av hög genomströmning sekvense
Summary
MicroRNAs (miRNAs) are a widely conserved class of regulatory molecules. Here we describe a miRNA cloning method that relies upon two potent ligation steps followed by high-throughput sequencing. Our method permits accurate genome-wide quantitation of miRNAs.
Abstract
Mirna kloning och hög genomströmning sekvensering, benämnd miR-Seq, står ensam som en transkriptom-omfattande strategi för att kvantifiera miRNA med enda nukleotid upplösning. Denna teknik fångar miRNAs genom att fästa 3 'och 5' oligonukleotidadaptorer till miRNA-molekyler och tillåter de novo miRNA upptäckt. Koppling med nästa generations kraftfulla sekvenseplattformar, har miR-Seq varit avgörande för att studera miRNA biologi. Dock har stora fördomar som införts av oligonukleotid ligation steg förhindrade miR-Seq från att vara anställd som en exakt kvantifiering verktyg. Tidigare studier visar att fördomar i dagens miR-Seq metoder leder ofta till felaktiga miRNA kvantifiering med fel på upp till 1.000 gånger för vissa miRNA 1,2. För att lösa dessa fördomar som ges av RNA ligation, har vi utvecklat en liten RNA ligation metod som leder till ligation effektivitet på över 95% för både 3 'och 5' ligerings steg. Benchmarking denna imbevisade biblioteksbyggmetod med hjälp av ekvimolära eller differentiellt blandade syntetiska miRNA, konsekvent ger läser tal med mindre än tvåfaldig avvikelse från det förväntade värdet. Dessutom tillåter denna högeffektiva miR-Seq-metoden exakt genomet hela miRNA profilering från in vivo totala RNA-prov 2.
Introduction
Hög genomströmning sekvensebaserade metoder har i stor utsträckning för många biologiska prover under de senaste åren kraftigt expanderande vår förståelse av den molekylära komplexiteten av biologiska system 3,4. Men beredning av RNA-prover för hög genomströmning sekvensering ger ofta konkreta fördomar som åtföljer en anställd metodik, som begränsar den potentiella nyttan av dessa kraftfulla tekniker. Dessa metodspecifika fördomar har dokumenterats väl för ligering baserad, små RNA-bibliotek preparat 1,2,5,6. Dessa fel leder till 1.000-faldig variation i läser siffror för ekvimolära syntetiska miRNA, vilket gör slutledning av miRNA överflöd från sekvensdata vilt varierande och fel benägna.
Studier med fokus på egenskaper hos fag-härledd T4 RNA ligaser har dokumenterat att enzymerna uppvisar nukleotid baserade preferenser 7, vilket manifesteras som partiska bibliotek i hög genomströmning sekvenseexperiment <sdig> 1,2,8. För att minimera de fördomar som ges av RNA-ligaser, flera strategier har använts; makromolekylära trängsel 9, randomisera nukleotidsekvensen på adaptern som är proximal till ligeringsstället 6, via höga koncentrationer av ligering adapter 2. Genom en kombination av dessa tre metoder har vi utvecklat ett arbetsflöde för opartisk framställning av små RNA-bibliotek är kompatibla för hög genomströmning sekvensering (Figur 1). För direkta jämförelser mellan dagens protokoll och vår optimerade metoden, se vår senaste rapport 2. Denna optimerade metod ger ligerings effektiviteter av större än 95% vid både 3 'och 5' steg och gör det möjligt att objektivt ligering av små RNA-molekyler från syntetiska och biologiska prov 2.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den metod som beskrivs här använder sig av flera viktiga variabler för att maximera ligeringsprodukter effektivitet, nämligen höga koncentrationer av PEG, användning av randomiserade länkare och hög koncentration av länkare 2,6,9. Detta tillvägagångssätt möjliggör tillförlitligt kvantitativa sekvense bibliotek från total RNA-prov 2. Vi har genomfört flera titreringar av input RNA och har kommit fram till att den föregående metoden passar bäst för total RNA belopp i 1-8 ug inter…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank members of the Yi laboratory especially Zhaojie Zhang for fruitful discussions regarding linker design and ligation efficiencies, as well as the American Cancer Society for supporting this work through a postdoctoral fellowship (#125209) to J.E.L. Research reported in this publication was also supported by the National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases of the National Institutes of Health under Award Number R01AR059697 (to R.Y.) and a research grant from the Linda Crnic Institute for Down Syndrome. The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institutes of Health.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 3' Linker (5' phosphorylated, 3' blocked) | Integrated DNA Technologies | custom | |
| 5' Linker | Integrated DNA Technologies | custom | 5' blocked, HPLC Purified |
| T4RNL2 (1-249 K227Q) | New England Biolabs | M0351S | Specialized for ligation of pre-adenylated DNA adapters |
| 10X Ligation Buffer (without ATP) | New England Biolabs | Included with M0351S | |
| 10X Ligation Buffer (with ATP) | New England Biolabs | Included with M0204L | |
| RNaseOUT | Invitrogen | 10777-019 | |
| Polyethylene Glycol (mol. Wt. 8000) | New England Biolabs | Included with M0204L | |
| Nuclease-free water | Ambion | AM9937 | We have found water collected from a distillation apparatus to be of equvalent quality. |
| T4RNL1 | New England Biolabs | M0204L | |
| Superscript III RT kit | Invitrogen | 18080-051 | |
| Phusion PCR kit | New England Biolabs | M0530S | |
| Illumina RP1 Primer | Integrated DNA Technologies | custom | Sequence information available from Illumina |
| Illumina RT Primer | Integrated DNA Technologies | custom | Sequence information available from Illumina |
| Illumina Index Primer(s) | Integrated DNA Technologies | custom | Sequence information available from Illumina |
| 40% Acrylamide | Fisher Scientific | BP14081 | |
| Urea | Sigma Aldrich | U6504 | |
| Ammonium persulfate | Sigma Aldrich | A3678 | |
| Tetramethyethylenediamine (TEMED) | Sigma Aldrich | T9281 | |
| 2X Denaturing RNA loading buffer | New England Biolabs | Included with M0351S | |
| Razor blades | VWR | 55411-050 | |
| SpinX Centricon Tubes | Costar | CLS8161 | |
| Low Retention Microfuge tubes | Fisher Scientific | 02-681-320 | |
| Sybr Gold | Invitrogen | S-11494 | |
| Adenylation Kit | New England Biolabs | E2610L |
References
- Hafner, M., et al. RNA-ligase-dependent biases in miRNA representation in deep-sequenced small RNA cDNA libraries. RNA. 17 (9), 1697-1712 (2011).
- Zhang, Z., Lee, J. E., Riemondy, K., Anderson, E. M., Yi, R. High-efficiency RNA cloning enables accurate quantification of miRNA expression by deep sequencing. Genome Biology. 14 (10), 109 (2013).
- Consortium, T. E. P. The ENCODE (ENCyclopedia Of DNA Elements) Project. Science. 306 (5696), 636-640 (2004).
- Consortium, T. E. P. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
- Linsen, S. E. V., et al. Limitations and possibilities of small RNA digital gene expression profiling. Nature Methods. 6 (7), 474-476 (2009).
- Jayaprakash, A. D., Jabado, O., Brown, B. D., Sachidanandam, R. Identification and remediation of biases in the activity of RNA ligases in small-RNA deep sequencing. Nucleic Acids Research. 39 (21), 141 (2011).
- McLaughlin, L. W., Romaniuk, E., Romaniuk, P. J., Neilson, T. The Effect of Acceptor Oligoribonucleotide Sequence on the T4 RNA Ligase Reaction. European Journal of Biochemistry. 125 (3), 639-643 (1982).
- Zhuang, F., Fuchs, R. T., Sun, Z., Zheng, Y., Robb, G. B. Structural bias in T4 RNA ligase-mediated 3′-adapter ligation. Nucleic Acids Research. 40 (7), 54 (2012).
- Harrison, B., Zimmerman, S. B. Polymer-stimulated ligation: enhanced ligation of oligo- and polynucleotides by T4 RNA ligase in polymer solutions. Nucleic Acids Research. 12 (21), 8235-8251 (1984).
- Torchia, C., Takagi, Y., Ho, C. K. Archaeal RNA ligase is a homodimeric protein that catalyzes intramolecular ligation of single-stranded RNA and DNA. Nucleic Acids Research. 36 (19), 6218-6227 (2008).
- Lau, N. C., Lim, L. P., Weinstein, E. G., Bartel, D. P. An Abundant Class of Tiny RNAs with Probable Regulatory Roles in Caenorhabditis elegans. Science. 294 (5543), 858-862 (2001).
- Yi, R., et al. DGCR8-dependent microRNA biogenesis is essential for skin development. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (2), 498-502 (2009).
- Leung, A. K. L., et al. Genome-wide identification of Ago2 binding sites from mouse embryonic stem cells with and without mature microRNAs. Nature Structural & Molecular Biology. 18 (2), 237-244 (2011).
