RNA 시퀀싱 분석하여 EML 조혈 전구체 세포의자가 재생 (self-renewal)과 분화를 조절하는 중요한 요소의 식별
Summary
RNA 시퀀싱과 생물 정보학 분석은 마우스 EMLcells의 린-CD34 + 린-CD34- 부분 집단에서 유의 및 발현 된 전사 인자를 식별하는 데 사용되었다. 이들 전사 인자는 자기 갱신 린-CD34 +를 부분적으로 분화 된 린 – CD34- 세포 사이의 스위치를 결정하는데 중요한 역할을 할 수도있다.
Abstract
조혈 줄기 세포 (조혈 모세포)는 백혈병과 림프종 등 많은 질병에 환자의 조혈 시스템을 다시 이식 치료를 위해 임상 적으로 사용된다. 조혈 모세포의자가 재생과 분화를 조절하는 메커니즘을 해명하는 연구 및 임상 사용을 위해 조혈 모세포 응용 프로그램에 대한 중요하다. 그러나 의한 시험 관내에서 증식 그들의 무능력 조혈 모세포의 대량을 얻을 수 없다. 이 장애물을 극복하기 위해, 우리는 본 연구를위한 모델 시스템으로, 마우스 골수 유래 세포주, EML (적혈구, 골수 및 림프) 세포주를 사용 하였다.
RNA 시퀀싱 (RNA-SEQ)는 점점 유전자 발현 연구를위한 마이크로 어레이를 대체하는 데 사용되어왔다. 여기서는 EML 세포 자기 갱신 및 분화의 조절에 중요한 요소 가능성을 조사하기 위해 RNA-SEQ 기술을 사용하는 상세한 방법을보고한다. 이 문서에서 제공하는 프로토콜은 세 부분으로 나누어 져 있습니다. 첫 번째 파T는 어떻게 문화 EML 세포와 별도의 린-CD34 + 린-CD34- 세포에 대해 설명합니다. 프로토콜의 두 번째 부분은 총 RNA 준비 및 높은 처리량 시퀀싱에 대한 후속 도서관 건설을위한 자세한 절차를 제공합니다. 마지막 부분은 RNA-SEQ 데이터 분석을위한 방법을 설명하고 린-CD34 + 및 CD34- 린 – 세포 간의 발현 된 전사 인자를 식별하는 데이터를 사용하는 방법을 설명합니다. 가장 현저하게 발현 된 전사 인자는 EML 세포 자기 갱신 및 분화를 제어하는 전위 키 레귤레이터 인 것으로 확인되었다. 이 글의 토론 섹션에서, 우리는이 실험의 성공적인 성능을위한 주요 단계를 강조 표시합니다.
요약하면, 본 연구는 EML 세포에자가 재생과 분화 잠재력 레귤레이터를 식별하기 위해 RNA-SEQ 기술을 사용하는 방법을 제공한다. 확인 된 주요 요인은 시험관과 내가 다운 스트림 기능 분석을 실시한다n 개의 생체.
Introduction
조혈 줄기 세포는 성인 골수 틈새에 주로 존재 희귀 혈액 세포이다. 이들은 혈액을 보충하기 위해 필요한 세포 및 면역 시스템 (1)의 제조를위한 책임이있다. 줄기 세포의 일종으로서, 조혈 모세포는자가 재생과 분화를 모두 할 수있다. 조혈 모세포의 운명 결정을 제어하는 메커니즘을 해명,자가 재생 (self-renewal) 또는 분화 중 하나를 향해, 혈액 질환 연구 및 임상 사용 2 조혈 모세포의 조작에 유용한 지침을 제공 할 것입니다. 연구자들이 직면 한 문제는 조혈 모세포가 유지되고 매우 제한적으로 시험 관내에서 확장 될 수 있다는 것이다; 그들의 자손의 대부분은 부분적으로 문화 2에서 차별화된다.
전체 게놈 규모에서 자기 갱신 및 분화 과정을 조절 키 레귤레이터를 식별하기 위해, 우리는 모델 시스템으로서 마우스 원시 조혈 전구 세포 라인 EML을 사용했다. 목세포주는 쥐의 골수 3,4에서 파생된다. 다른 성장 인자가 공급되면, EML 세포는 시험 관내에서 5 적혈구, 골수 및 림프 세포로 분화 할 수있다. 중요한 것은,이 세포주 배양 배지가 multipotentiality 유지 여전히 줄기 세포 인자 (SCF)를 함유하고에서 다량으로 전파 될 수있다. EML 세포는 자기 갱신 린 – SCA + CD34 +의 아 집단으로 분리 부분적 표면 마커 CD34 및 SCA 6에 근거 린 – SCA-CD34- 세포를 구별 할 수있다. 단기 조혈 모세포, SCA + CD34 + 세포와 마찬가지로 자기 갱신 할 수 있습니다. 빠르게 린-SCA + CD34 + 린-SCA-CD34- 세포의 혼합 인구를 재생 및 6 증식을 계속할 수 SCF, 린-SCA + CD34 + 세포로 치료합니다. 두 집단은 형태에 유사하며 C-키트의 mRNA와 단백질 6 비슷한 수준을 가지고있다. 린 – SCA-CD34- 세포는 IL-3 대신 SCF 3을 함유하는 배지에서 증식 할 수있다. UnveilinG 조혈 초기의 발달 전환 세포 및 분자 메커니즘의 더 나은 이해를 제공 할 것입니다 EML 세포 운명 결정의 핵심 규제.
자기 갱신 린 – SCA + CD34 + 및 부분적으로 분화 된 린 – SCA-CD34- 세포 사이의 기본적인 분자 적 차이를 조사하기 위해, 우리는 발현 된 유전자를 확인하기 위해 RNA-SEQ을 사용했다. 전사 인자는 세포의 운명 결정에 결정적으로 우리는 특히, 전사 인자에 초점. RNA-SEQ의 프로필과 게놈 7,8로부터 전사 된 RNA를 정량화 (NGS) 기술 차세대 시퀀싱 기능을 이용하는 최근에 개발 된 방법이다. 간단히, 총 RNA는 폴리 초기 template.The RNA 템플릿은 다음 역전사 효소를 이용하여 cDNA를로 변환으로 선택하고 조각. cDNA 라이브러리 구축 속담 비 저하 된 RNA를 사용하여 전체 길이의 RNA 전 사체를 매핑하기 위해 중요하다. 끝까지 마음을 위해시퀀싱 포즈, 특정 어댑터 서열의 cDNA의 양단에 추가된다. 그리고, 대부분의 경우, cDNA의 분자는 PCR에 의해 증폭되고, 높은 처리량 방법으로 서열 분석.
서열 분석 후, 생성 된이 기준 게놈 전 사체 데이터베이스에 정렬 될 수 읽는다. 수는 기준 유전자지도를 카운트하고,이 정보를 유전자 발현 량을 추정하는데 사용될 수 있음을 읽는다. 또한 비 유기체 모델 9 transcriptomes의 연구를 가능 기준 게놈없이 드 노보를 조립할 수 읽는다. RNA-SEQ 기술은 또한 접합부 동종 10-12, 신규 전 사체 (13)와 유전자 융합체 (14)를 검출하는데 사용되어왔다. 단백질 코딩 유전자의 검출에 더하여, RNA-SEQ도 같은 비 – 코딩의 RNA의 전사 수준을 소설을 검출하고 분석하는 데 사용될 수 긴 siRNA와 등 (18) RNA 15, 16, 마이크로 RNA (17), 비 – 코딩. 때문에 t의이 방법의 정밀도 그는, 그것은 단일 염기 변이 (19, 20)의 검출에 이용되고있다.
RNA-SEQ 기술의 출현 전에 마이크로 어레이 유전자 발현 프로파일을 분석하기 위해 사용되는 주요 방법이었다. 사전 설계된 프로브를 합성하고,이어서 마이크로 어레이 슬라이드 (21)를 형성하도록 고체 표면에 부착된다. mRNA를 추출하여 cDNA를 변환된다. 역전사 과정에서 형광 표지 된 뉴클레오티드의 cDNA에 편입되고하는 cDNA 마이크로 어레이는 슬라이드에 혼성화 될 수있다. 특정 지점에서 수집 된 신호의 세기는 그 스폿 (21) 상에 특이 적 프로브에 결합 된 cDNA의 양에 의존한다. RNA-SEQ 기술에 비해, 마이크로 어레이는 몇 가지 제한 사항이 있습니다. RNA-SEQ 기술의 사용을 제한 할 때 상대적으로 높은 배경 수준에서 신규 전 사체를 검출 할 수있는 동안 첫째, 마이크로 어레이 유전자 주석의 기존 지식에 의존 GENE 발현 수준이 낮습니다. 때문에 배경 및 신호의 포화, 마이크로 어레이의 정확성은 모두 높은 및 낮은 발현 유전자 7,22에 대한 제한, 반면 게다가, RNA-SEQ 기술은 탐지 (8,000 배) 7 훨씬 높은 동적 범위를 가지고있다. 마지막으로, 마이크로 어레이 프로브는 하나의 샘플 (23) 내의 다른 사체의 상대적인 발현 수준을 비교할 때 결과를 덜 신뢰성있는 그들의 혼성화 효율, 다르다. RNA-SEQ은 마이크로 어레이에 비해 많은 장점을 가지고 있지만, 데이터 분석은 복잡하다. 이것은 많은 연구자들이 여전히 RNA-SEQ 대신 마이크로 어레이를 사용하는 이유 중 하나입니다. 다양한 생물 정보학 도구 RNA-SEQ 데이터 처리 및 분석 (24)에 요구된다.
여러 차세대 시퀀싱 (NGS) 플랫폼 중 454, Illumina 사, SOLID 및 이온 런트는 가장 널리 사용되는 것들이다. (454)는 최초의 상용 NGS 플랫폼이었다. 다른 시퀀싱 플랫폼 달리같은 Illumina의 고체로, 454 플랫폼은 더 이상 읽을 생성 길이는 25 (평균 700 기본 읽기). 인해 더 이상 높은 효율 (25)을 조립 자신에 transcriptiome의 초기 특성에 대한 더 나은 읽습니다. 454 플랫폼의 주요 단점은 시퀀스의 megabase 당 높은 비용이다. 생성 일루미나와 SOLID 플랫폼이 증가 숫자와 짧은 길이로 읽습니다. 시퀀스의 megabase 당 비용은 454 플랫폼보다 훨씬 낮다. 때문에 일루미나와 SOLID 플랫폼 읽고 단락의 큰 숫자로, 데이터 분석이 훨씬 더 계산 집약적이다. 이온 토렌트 플랫폼에 대한 시퀀싱 장비 및 시약의 가격은 저렴하고 시퀀싱 시간은 25 짧습니다. 그러나, 에러율 시퀀스 megabase 당 비용이 높은 일루미나 SOLID 플랫폼과 비교된다. 다른 플랫폼은 자신의 장점과 단점을 가지고 데이터 분석을위한 다른 방법이 필요하다. 괞 찮아TForm 클래스는 시퀀싱 목적과 자금의 가용성에 따라 선택해야합니다.
이 논문에서, 우리는 예를 들어 일루미나 RNA-SEQ 플랫폼을. 우리는 EML 세포자가 재생과 분화에 중요한 레귤레이터를 조사하기 위해 모델 시스템으로서 EML 셀을 사용하고, 발현 량의 계산 및 신규 사체 검출 용 RNA-SEQ 라이브러리 구축 및 데이터 분석의 상세한 방법을 제공 하였다. 우리는 EML 모델 시스템 (2)에서 RNA-SEQ 연구 때 기능 테스트 (예 shRNA를 녹다운) 조혈 분화의 초기 단계의 분자 적 메카니즘을 이해하는 강력한 방법을 제공하여 결합 된 우리의 이전의 간행물에 도시 한와 같이 작용할 수 일반적으로 세포의자가 재생과 분화의 분석을위한 모델.
Protocol
Representative Results
Discussion
포유 동물의 사체는 34-38 매우 복잡하다. RNA-SEQ 기술은 유전자 발현 분석을위한 다른 방법에 비해 많은 장점을 가지고 사체 분석, 신규 성적 검출 및 단일 뉴클레오타이드 변이 검색 등의 연구에서 점점 더 중요한 역할을한다. 도입부에서 언급 한 바와 같이, 그 마이크로 어레이 혼성화 아티팩트를 극복하고 새로운 사체 드 노보를 식별하는데 사용될 수있다. RNA 시퀀싱의…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
JQW, SZ, SD and KC are supported by grant from the National Institutes of Health and the Staman Ogilvie Fund—Memorial Hermann Foundation.
Materials
| Antibiotic-Antimycotic | Invitrogen | 15240-062 | BHK cell culture |
| Anti-Mouse CD34 FITC | eBioscience | 11-0341-81 | FACS sorting |
| Anti-Mouse Ly-6A/E (Sca-1) PE | eBioscience | 12-5981-81 | FACS sorting |
| APC Mouse Lineage Antibody Cocktail | BD Biosciences | 558074 | FACS sorting |
| BD FACSAria Cell Sorter | BD Biosciences | Special offer sysmtem | FACS sorting |
| Corning™ Cell Culture Treated Flasks 75cm2 | Corning incorporated | 430641 | Cell culture |
| Corning™ Cell Culture Treated Flasks 25cm2 | Corning incorporated | 430639 | Cell culture |
| Deoxyribonuclease I, Amplification Grade | Invitrogen | 18068-015 | Library preparation |
| DMEM | Invitrogen | 11965-092 | BHK cell culture |
| DPBS | Gibco | 14190 | Cell culture |
| HI FBS | Invitrogen | 16140071 | BHK cell culture |
| Horse Serum | Invitrogen | 16050-122 | EML cell culture |
| IMDM | HyClone | SH30228.02 | EML cell culture |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030-081 | Cell culture |
| Lineage Cell Depletion Kit, mouse | Miltenyi Biotec | 130-090-858 | Isolation of lineage negative cells |
| NanoVue Plus spectrophotometer | GE Healthcare | 28-9569-62 | Quality control |
| Thermo Scientific™ Napco™ 8000 Water-Jacketed CO2 Incubators | Thermo Scientific | 15-497-002 | Cell culture |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | EML cell culture |
| TRIzol® Reagent | Invitrogen | 15596-018 | RNA exraction |
| TruSeq™ RNA Sample Prep Kit v2 -Set B (48rxn) | Illumina | RS-122-2002 | Library preparation |
| 2100 Electrophoresis Bioanalyzer Instrument | Agilent | G2939AA | Quality control |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200 | Cell culture |
| 0.45 µm Syringe Filters | Nalgene | 190-2545 | Cell culture |
References
- Chambers, S. M., Goodell, M. A. Hematopoietic stem cell aging: wrinkles in stem cell potential. Stem Cell Rev. 3, 201-211 (2007).
- Wu, J. Q., et al. Tcf7 is an important regulator of the switch of self-renewal and differentiation in a multipotential hematopoietic cell line. PLoS genetics. 8, (2012).
- Ye, Z. J., et al. Complex interactions in EML cell stimulation by stem cell factor and IL-3. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 4882-4887 (2011).
- Tsai, S., Bartelmez, S., Sitnicka, E., Collins, S. Lymphohematopoietic progenitors immortalized by a retroviral vector harboring a dominant-negative retinoic acid receptor can recapitulate lymphoid, myeloid, and erythroid development. Genes Dev. 8, 2831-2841 (1994).
- Weiler, S. R., et al. D3: a gene induced during myeloid cell differentiation of Linlo c-Kit+ Sca-1(+) progenitor cells. Blood. 93, 527-536 (1999).
- Ye, Z. J., Kluger, Y., Lian, Z., Weissman, S. M. Two types of precursor cells in a multipotential hematopoietic cell line. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 18461-18466 (2005).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nature reviews. Genetics. 10, 57-63 (2009).
- Chu, Y., Corey, D. R. RNA sequencing: platform selection, experimental design, and data interpretation. Nucleic acid therapeutics. 22, 271-274 (2012).
- Hornett, E. A., Wheat, C. W. Quantitative RNA-Seq analysis in non-model species: assessing transcriptome assemblies as a scaffold and the utility of evolutionary divergent genomic reference species. BMC genomics. 13, 361 (2012).
- Eswaran, J., et al. RNA sequencing of cancer reveals novel splicing alterations. Scientific reports. 3, 1689 (2013).
- Wang, E. T., et al. Alternative isoform regulation in human tissue transcriptomes. Nature. 456, 470-476 (2008).
- Wu, J. Q., et al. Dynamic transcriptomes during neural differentiation of human embryonic stem cells revealed by short, long, and paired-end sequencing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 5254-5259 (2010).
- Loraine, A. E., McCormick, S., Estrada, A., Patel, K., Qin, P. RNA-seq of Arabidopsis pollen uncovers novel transcription and alternative splicing. Plant physiology. 162, 1092-1109 (2013).
- Edgren, H., et al. Identification of fusion genes in breast cancer by paired-end RNA-sequencing. Genome biology. 12, 6 (2011).
- Ilott, N. E., Ponting, C. P. Predicting long non-coding RNAs using RNA sequencing. Methods. 63, 50-59 (2013).
- Sun, L., et al. Prediction of novel long non-coding RNAs based on RNA-Seq data of mouse Klf1 knockout study. BMC bioinformatics. 13, 331 (2012).
- Luo, S. MicroRNA expression analysis using the Illumina microRNA-Seq Platform. Methods in molecular biology. 822, 183-188 (2012).
- Bolduc, F., Hoareau, C., St-Pierre, P., Perreault, J. P. In-depth sequencing of the siRNAs associated with peach latent mosaic viroid infection. BMC molecular biology. 11, 16 (2010).
- Chepelev, I., Wei, G., Tang, Q., Zhao, K. Detection of single nucleotide variations in expressed exons of the human genome using RNA-Seq. Nucleic acids research. 37, 106 (2009).
- Djari, A., et al. Gene-based single nucleotide polymorphism discovery in bovine muscle using next-generation transcriptomic sequencing. BMC genomics. 14, 307 (2013).
- Murphy, D. Gene expression studies using microarrays: principles, problems, and prospects. Advances in physiology education. 26, 256-270 (2002).
- Chen, K., et al. RNA-seq characterization of spinal cord injury transcriptome in acute/subacute phases: a resource for understanding the pathology at the systems level. PLoS one. 8, 72567 (2013).
- Marioni, J. C., Mason, C. E., Mane, S. M., Stephens, M., Gilad, Y. RNA-seq: an assessment of technical reproducibility and comparison with gene expression arrays. Genome research. 18, 1509-1517 (2008).
- Ramskold, D., Kavak, E., Sandberg, R. How to analyze gene expression using RNA-sequencing data. Methods in molecular biology. 802, 259-274 (2012).
- Glenn, T. C. Field guide to next-generation DNA sequencers. Mol Ecol Resour. 11, 759-769 (2011).
- Trapnell, C., et al. Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks. Nature protocols. 7, 562-578 (2012).
- Trapnell, C., Pachter, L., Salzberg, S. L. TopHat: discovering splice junctions with RNA-Seq. Bioinformatics. 25, 1105-1111 (2009).
- Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome biology. 10, 25 (2009).
- Trapnell, C., et al. Transcript assembly and quantification by RNA-Seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation. Nature. 28, 511-515 (2010).
- Anders, S., Huber, W. Differential expression analysis for sequence count data. Genome biology. 11, 106 (2010).
- Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26, 841-842 (2010).
- Cheranova, D., et al. RNA-seq analysis of transcriptomes in thrombin-treated and control human pulmonary microvascular endothelial cells. J Vis Exp. , (2013).
- Zhang, H. M., et al. AnimalTFDB: a comprehensive animal transcription factor database. Nucleic acids research. 40, 144-149 (2012).
- Wu, J. Q., et al. Systematic analysis of transcribed loci in ENCODE regions using RACE sequencing reveals extensive transcription in the human genome. Genome Biol. 9, 3 (2008).
- Wu, J. Q., et al. Large-scale RT-PCR recovery of full-length cDNA clones. Biotechniques. 36, 690-696 (2004).
- Wu, J. Q., Shteynberg, D., Arumugam, M., Gibbs, R. A., Brent, M. R. Identification of rat genes by TWINSCAN gene prediction, RT-PCR, and direct sequencing. Genome Res. 14, 665-671 (2004).
- Dewey, C., et al. Accurate identification of novel human genes through simultaneous gene prediction in human, mouse, and rat. Genome Res. 14, 661-664 (2004).
- Wu, J. . Characterize Mammalian Transcriptome Complexity. , (2011).
