Identification des facteurs clés de régulation auto-renouvellement et de différenciation dans les cellules hématopoïétiques précurseurs EML par l'analyse de l'ARN-séquençage

Résumé

Analyses ARN de séquençage et de bioinformatique ont été utilisés pour identifier les facteurs de transcription de manière significative et exprimés de manière différentielle dans des sous-populations Lin-CD34 + et CD34 Lin-des EMLcells de souris. Ces facteurs de transcription peuvent jouer un rôle important dans la détermination de l'interrupteur entre les cellules Lin-CD34 auto-renouvellement Lin-CD34 + et partiellement différenciés.

Résumé

Les cellules souches hématopoïétiques (CSH) sont utilisés en clinique pour le traitement de la greffe à reconstruire le système hématopoïétique d'un patient dans de nombreuses maladies telles que la leucémie et le lymphome. Élucider les mécanismes contrôlant CSH auto-renouvellement et de différenciation est important pour l'application de CSH pour la recherche et les utilisations cliniques. Cependant, il est impossible d'obtenir des CSH en grande quantité en raison de leur incapacité à proliférer in vitro. Pour surmonter cet obstacle, nous avons utilisé une lignée de cellules dérivées de la moelle osseuse de souris, la lignée cellulaire EML (érythroïde, myéloïde et lymphoïde), en tant que système modèle pour cette étude.

ARN-séquençage (ARN-Seq) a été de plus en plus utilisés pour remplacer les puces à ADN pour les études d'expression génique. Nous rapportons ici une méthode détaillée de l'utilisation de la technologie de l'ARN-Seq pour enquêter sur les facteurs clés potentiels dans la régulation de la cellule EML auto-renouvellement et de différenciation. Le protocole fourni dans le présent document est divisé en trois parties. La première part explique comment la culture de cellules EML et séparé Lin-CD34 + et les cellules Lin-CD34. La deuxième partie du protocole propose des procédures détaillées pour la préparation d'ARN total et la construction de la bibliothèque ultérieure pour le séquençage à haut débit. La dernière partie décrit la méthode d'analyse de données RNA-Seq et explique comment utiliser les données pour identifier les facteurs de transcription exprimés de manière différentielle entre Lin-CD34 + et les cellules Lin-CD34. Les facteurs de transcription plus nettement exprimés de manière différentielle ont été identifiés comme les principaux régulateurs potentiels contrôle cellule EML auto-renouvellement et de différenciation. Dans la section de discussion de cet article, nous mettons en évidence les étapes clés de la performance réussie de cette expérience.

En résumé, ce document propose une méthode d'utilisation de la technologie de l'ARN-Seq pour identifier des régulateurs potentiels de l'auto-renouvellement et de différenciation dans les cellules EML. Les principaux facteurs identifiés sont soumis à l'analyse fonctionnelle en aval in vitro et in vivo.

Introduction

Les cellules souches hématopoïétiques sont des cellules sanguines rares qui se trouvent principalement dans la niche de la moelle osseuse adulte. Ils sont responsables de la production de cellules nécessaires pour reconstituer le sang et le système immunitaire ^1. Comme une sorte de cellules souches, cellules souches hématopoïétiques sont capables à la fois de l'auto-renouvellement et de différenciation. Mécanismes qui contrôlent la décision de sort de CSH élucider, soit vers l'auto-renouvellement ou de la différenciation, offrira de précieux conseils sur la manipulation de cellules souches hématopoïétiques pour les recherches de maladies du sang et....

Protocole

1. EML culture cellulaire et la séparation des cellules Lin-CD34 + et CD34-Lin en utilisant la cellule magnétique Système et tri cellulaire activé par fluorescence méthode de tri

1. Préparation de rein de bébé hamster (BHK), du milieu de culture de cellules pour la collecte de facteur de cellules souches:
   1. Culture des cellules BHK dans un milieu DMEM contenant 10% de FBS en flacon de 25 ^cm2 (voir le tableau 1) à 37 ° C, 5% _de CO2 dans un incubateur de culture cellulaire.
   2. Lorsque les cellules se développent à 80 - 90% de confluence, laver les cellules une fois avec 10 ml de PBS. Ajouter 5 ml de solution ....

Résultats

Afin d'analyser les gènes exprimés de manière différentielle dans Lin-CD34 + et les cellules Lin-CD34 EML, nous avons utilisé la technologie de l'ARN-Seq. La figure 1 montre le flux de travail des procédures. Après isolement de cellules de la lignée négatifs par tri magnétique de cellules, nous nous sommes séparés Lin-SCA + CD34 + et les cellules Lin-SCA-CD34 en utilisant FACS Aria. EML cellules Lin-enrichis ont été colorées avec anti-CD34, anti-Sca1 et anticorps de cocktail de la lignée. Seules les cel.......

Discussion

Transcriptome des mammifères est très complexe ^34-38. technologie de l'ARN-Seq joue un rôle de plus en plus important dans les études d'analyse du transcriptome, roman détection des transcriptions et seul nucléotide découverte de variation etc. Il présente de nombreux avantages par rapport aux autres méthodes d'analyse de l'expression des gènes. Comme mentionné dans l'introduction, il surmonte les artefacts d'hybridation de micro-réseau et peut être utilisé pour identif.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Antibiotique-Antimycosique	Invitrogen	15240-062	Culture cellulaire BHK
Anti-souris CD34 FITC	eBioscience	11-0341-81	Tri FACS
Anti-souris Ly-6A/E (Sca-1) PE	eBioscience	12-5981-81	Tri
FACS Lignée de souris Cocktail d’anticorps	BD Biosciences	558074	Tri FACS
Trieur de cellules FACSAria	BD Biosciences	Offre spéciale sysmtem	FACS tri
Corning&trade ; Fioles traitées pour culture cellulaire 75 cm2	Corning incorporé	430641	Culture cellulaire
Corning&trade ; Culture cellulaire Flacons traités 25 cm2	Corning incorporé	430639	Culture cellulaire
Désoxyribonucléase I, Amplification Grade	Invitrogen	18068-015 Préparation de	la bibliothèque
DMEM	Invitrogen	11965-092	BHK culture cellulaire
DPBS	Gibco	14190	Culture cellulaire
HI FBS	Invitrogen	16140071	Culture cellulaire BHK
Sérum de cheval	Invitrogen	16050-122	Culture cellulaire EML
IMDM	HyClone	SH30228.02	Culture cellulaire EML
L-Glutamine	Invitrogen	25030-081	Culture cellulaire
Kit de déplétion cellulaire de lignée, souris	Miltenyi Biotec	130-090-858	Isolement des cellules négatives de lignée
Spectrophotomètre NanoVue Plus	GE Healthcare	28-9569-62	Contrôle de la qualité
Thermo Scientific&trade ; Napco&commerce ; 8000 Incubateurs CO2 à chemise d’eau	Thermo Scientific	15-497-002	Culture cellulaire
Pénicilline-Streptomycine	Invitrogen	15140-122	Culture cellulaire EML
TRIzol® ; Réactif	Invitrogen	15596-018	Exraction d’ARN
TruSeq&trade ; Kit de préparation d’échantillons d’ARN v2 -Set B (48 rxn)	Illumina	RS-122-2002 Préparation de	la bibliothèque
2100 Électrophorèse Bioanalyseur Instrument	Agilent	G2939AA	Contrôle qualité
0,25 % Trypsine-EDTA	Gibco	25200	Culture cellulaire
0,45 & micro ; m Seringue Filtres	Nalgene	190-2545	Culture cellulaire

BD