The accessibility of reliable models to investigate vascular blood interactions in humans is lacking. We present an in vitro model of cultured primary human endothelial cells combined with human whole blood to investigate cellular interactions both in the blood (ELISA) and the vascular compartment (microscopy).
सभी ज्ञात रोगों के बहुमत हृदय प्रणाली के विकारों के साथ कर रहे. हृदय विकृतियों के दौरान सक्रिय बातचीत रास्ते की जटिलता में अध्ययन, हालांकि, मजबूत और physiologically प्रासंगिक तरीकों के अभाव के कारण सीमित कर रहे हैं. रोग संवहनी घटनाओं मॉडल करने के क्रम में हम अन्तःचूचुक और पूरे रक्त के बीच बातचीत के अध्ययन के लिए इन विट्रो परख विकसित किया है. परख मानव पूरे रक्त के संपर्क में रखा जाता है जो प्राथमिक मानव endothelial कोशिकाओं के होते हैं. विधि एक रक्त वाहिका में वर्तमान आणविक और सेलुलर घटकों के बीच नाजुक संबंधों के अध्ययन को सक्षम करने, नहीं या बहुत कम थक्कारोधी साथ देशी खून का इस्तेमाल करता.
हम साथ या मानव नाल नस endothelial कोशिकाओं (HUVEC) के बिना incubated अलग रक्त संस्करणों द्वारा जमावट की सक्रियता की तुलना द्वारा परख की कार्यक्षमता की जांच की. एक बड़ा रक्त की मात्रा में योगदान दिया जबकिथ्रोम्बिन antithrombin के गठन में वृद्धि (बुनना) परिसरों, HUVEC की उपस्थिति जमावट की कम सक्रियण में हुई. HUVEC ट्यूमर नेक्रोसिस फैक्टर (TNFα) के साथ प्रेरित और रक्त संपर्क के बाद unstimulated कोशिकाओं की तुलना में TNFα कोशिकाओं प्रेरित पर काफी अधिक होने की CD16 + कोशिकाओं की उपस्थिति पाया करने के लिए इसके अलावा, हम ल्युकोसैट लगाव की छवि विश्लेषण आवेदन किया. अंत में, परख अन्तःचूचुक और रक्त डिब्बे के बीच बातचीत परेशान कर रहे हैं जहां संवहनी विकृतियों, अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है.
हृदय रोग में रक्त-संवहनी बातचीत का विश्लेषण करने के लिए तरीके आम तौर पर पशु अनुसंधान प्रयोगों शामिल है. प्रायोगिक अनुसंधान पशु मॉडल में बनाया परिणाम, तथापि,. मानव रोग के लिए बहुत कम या कोई निहितार्थ है जैसे 1,2 सकता है, रक्त कम्पार्टमेंट और संवहनी endothelial कोशिकाओं में बीच बातचीत सेलुलर जांच करने के लिए इन विट्रो मॉडल में अच्छा और विश्वसनीय के लिए एक की जरूरत है एक मानव की तरह प्रणाली. इसलिए हम एक रक्त endothelial सेल चैम्बर मॉडल की स्थापना की है. इस biomaterials और मानव पूरे रक्त के बीच बातचीत की जांच करने के लिए इस्तेमाल एक पहले से वर्णित मॉडल पर आधारित है. आमतौर पर शुद्ध घटकों, की संख्या सीमित है, जहां अन्य में इन विट्रो setups के लिए 3 विपरीत यानी, thrombocytes, ल्यूकोसाइट्स या endothelial कोशिकाओं उपलब्ध हैं, वर्तमान मॉडल सभी को शामिल किया गया घटकों एक रक्त वाहिका में प्रस्तुत करते हैं.
रक्त एन्दोथेलिअल सी का सेटअपपक्ष चैम्बर मॉडल कम या कोई जोड़ा थक्कारोधी साथ हौसले से तैयार की गई मानव रक्त का उपयोग सक्षम बनाया गया है. अब समय अवधि के दौरान संग्रहित रक्त तो एरिथ्रोसाइट्स के टूटने के रक्त और endothelial कोशिकाओं के बीच नाजुक संबंधों के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं जहां भंडारण घावों बुलाया हासिल. 4
पूर्व vivo पूरे रक्त की हैंडलिंग के दौरान थक्का बनने से बचने के लिए थक्कारोधी की या रक्त के संपर्क में सभी सामग्री गैर सक्रिय होने की जरूरत है कि उच्च खुराक या तो की आवश्यकता है. गैर सक्रिय करने सतहों प्रयोगशाला वातावरण में दुर्लभ हैं, सामग्री वैकल्पिक रूप से अप्रयुक्त हेपरिन की एक सुरक्षात्मक परत के साथ सुसज्जित किया जा सकता है. अप्रयुक्त हेपरिन की एक सुरक्षात्मक परत खून संपर्क जमावट झरना की एक सक्रियण के कारण के बिना हो सकता है, जहां एक सतह बनाने के सबसे सामग्री के लिए लागू किया जा सकता है (इसके बाद Corline हेपरिन सतह (सीएचएस) के रूप में). 5 प्रकार, साथ कक्षों प्रस्तुत द्वारा सीएचएस, रक्त एन्दोथेलिअल सीईडालूँगा चैम्बर मॉडल रक्त में थक्का-रोधी के बहुत कम मात्रा का उपयोग सक्षम बनाता है. रक्त एन्दोथेलिअल चैम्बर मॉडल में थक्कारोधी की उच्च सांद्रता के अलावा बचना अन्यथा नकाबपोश जा सकता है कि एक रक्त वाहिका के भीतर संवेदनशील बातचीत का अध्ययन करने के लिए यह संभव बनाता है. 6
एक प्लास्टिक खुर्दबीन स्लाइड के लिए:;: (9 मिमी त्रिज्या 8 मिमी ऊंचाई) रक्त endothelial सेल चैम्बर मॉडल प्लास्टिक सिलेंडरों संलग्न द्वारा गठित दो कक्षों के होते हैं. सिलेंडरों पर ऊपर की ओर का सामना करना पड़ किनारों सेल संस्कृति स्लाइड के खिलाफ कक्षों सीलिंग के लिए इस्तेमाल किया रबर O- अंगूठी के साथ लगे हैं कि खांचे से लैस हैं. कक्षों केवल आंशिक रूप से कक्षों बाद में एक ऊर्ध्वाधर स्थिति (चित्रा 1) में घुमाया जाता है जब कक्ष में छोड़ा हवा आंदोलन में खून रहता है खून से भर रहे हैं.
मॉडल की कार्यक्षमता का आकलन करने के लिए, हम या तो एक पूरी तरह से सीएचएस लेपित साथ प्रयोगों का प्रदर्शनचैम्बर या मानव नाल की शिरा endothelial कोशिकाओं (HUVEC). दो अलग-अलग रक्त संस्करणों assayed गया और थ्रोम्बिन antithrombin (बुनना) परिसरों (जमावट का एक अप्रत्यक्ष मार्कर) के गठन एंजाइम लिंक्ड immunosorbent परख (एलिसा) के साथ मापा गया था. हम तो रक्त की मात्रा और ट्यूमर नेक्रोसिस फैक्टर (TNFα) छवि विश्लेषण द्वारा ल्युकोसैट भर्ती पर endothelial कोशिकाओं उत्तेजित के प्रभाव का आकलन किया.
रक्त endothelial सेल चैम्बर मॉडल 1. सेटअप चित्रा. (ए) के शीर्ष PMMA में किए गए रक्त चैम्बर के योजनाबद्ध ड्राइंग देखने. (बी) प्राथमिक मानव endothelial कोशिकाओं 1-अच्छी तरह चैम्बर स्लाइड्स पर संवर्धित कर रहे हैं. ताजा मानव पूरे रक्त एक खुर्दबीन स्लाइड पर दो कक्षों में जोड़ा जाता है. खून से निपटने के लिए इस्तेमाल किया कक्षों और सभी सामग्री एक सुरक्षात्मक एच एस कोटिंग के साथ व्यवहार कर रहे हैं. सीई की दीवारों को हटाने के बादडालूँगा संस्कृति स्लाइड, कोशिकाओं रक्त का सामना करना पड़ रखा जाता है और सिस्टम बंद clamped है. (सी) रक्त endothelial सेल कक्षों तो 37 डिग्री सेल्सियस में रोटेशन के तहत incubated हैं. बाद में, रक्त डिब्बे में प्रतिक्रियाओं एलिसा द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है और endothelial कोशिकाओं माइक्रोस्कोपी द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है.
रक्त और पोत दीवार के बीच कई मुलाकातों सामान्य रूप से होने के कारण अन्तःचूचुक की गैर चिपकने वाला और विरोधी थ्रोम्बोटिक प्रकृति को एक मौन अवस्था में रखा जाता है. 7 सूजन से जुड़े रोग की स्थिति के दौरान, अन्तःचूचुक आसंजन रिसेप्टर अभिव्यक्ति 8 में एक परिणामस्वरूप वृद्धि के साथ सक्रिय हो जाता है और एक कम क्षमता को बाधित करने के लिए रक्तस्तम्भन. बदले में रक्त में झरना प्रणालियों के 9 सक्रियण आगे घनास्त्रता और ल्युकोसैट भर्ती के कारण अन्तःचूचुक की thrombogenicity amplifies. 10 endothelial कोशिकाओं और पूरे रक्त के बीच इस नाजुक बातचीत का एक बेहतर समझ हासिल करने के लिए, हम हैं सुसंस्कृत endothelial कोशिकाओं पूरे रक्त के संपर्क में रखा जाता है जहां इन विट्रो विधि में एक उपन्यास का विकास किया. हमारे ज्ञान करने के लिए, हमारे सेटअप अब समय अवधि के लिए कोई साथ पूरे मानव रक्त या बहुत कम थक्कारोधी साथ incubated endothelial कोशिकाओं को दिखाने के लिए पहली बार है.
NT "> इस प्रणाली की संवेदनशीलता रक्त के संपर्क में रखा सभी सतहों पर अप्रयुक्त हेपरिन की एक सुरक्षात्मक परत के साथ संयोजन में खुली प्रणाली venipuncture से सक्षम है. खून की खरीद के दौरान एक खुली प्रणाली का उपयोग venipuncture दौरान झरना सिस्टम की सक्रियता कम कर देता है थक्कारोधी के एक स्व-निर्धारित राशि के उपयोग की अनुमति है whilst. व्यावसायिक रूप से उपलब्ध खाली रक्त नलियों, हालांकि, अध्ययन का इरादा अंत अंक के आधार पर किया जा सकता है. सबसे व्यावसायिक रूप से उपलब्ध बंद व्यवस्था ट्यूबों में जोड़ा थक्कारोधी के अंतिम एकाग्रता संवेदनशील बाधित कर सकते हैं , और नहीं तो मुश्किल सेटअप में, बातचीत का अध्ययन करने के लिए. 6 एक सुरक्षात्मक हेपरिन सतह आगे endothelial कोशिकाओं के अलावा किसी अन्य सतहों से सतह संपर्क के माध्यम से रक्त की सक्रियता समाप्त. 5 दरअसल, unfractionated हेपरिन की एक छोटी राशि में साथ पूरक पूरे रक्त की ऊष्मायन सीएचएस के संरक्षण के बिना चैम्बर थक्का बनने में हुई. <pवर्ग = "jove_content"> कक्ष के अंदर हवा बुलबुला endothelial कोशिकाओं के साथ ऊष्मायन के दौरान रक्त के मिश्रण में सक्षम बनाता है. हवा बुलबुला आकार के प्रभाव का आकलन करने के लिए, हम दो अलग रक्त खंडों का इस्तेमाल किया. इस मॉडल में, हम HUVEC साथ incubated कक्षों में की परवाह किए बिना हवा बुलबुला आकार के समान बुनना के स्तर मापा. जैसे हालांकि, पूरी तरह से सीएचएस में एक छोटे हवाई बुलबुले के आकार के साथ वृद्धि हुई कक्षों का इलाज किया था. यह पहले से वर्णित endothelial सेल गुणों 11 के अनुसार, अक्रिय सीएचएस कक्ष में कमी है कि endothelial कोशिकाओं द्वारा प्रदान की जमावट की वृद्धि हुई सक्रियण पर एक विनियामक प्रभाव को दर्शाता है. प्रणाली में हवा बुलबुला चैंबर के रोटेशन पर एक प्रवाह पैदा करता है. बुलबुला का आकार इस घूर्णन प्रणाली के भीतर बलों को प्रभावित करेगा. यह एक छोटे बुलबुला रक्त यानी पर एक कम बल का प्रतिनिधित्व उच्च जैसे मूल्यों बनाता चित्रा 2 डी में हमारे परिणामों से थे दिखाया गया है, रक्त आंदोलनचैम्बर कम है और झरना प्रणाली की जिससे सक्रियण एक उच्च सीमा तक होती है भीतर. यह इस प्रणाली में हम दीवारों और केंद्र में सबसे कम के साथ सबसे ज्यादा तेजी के साथ चैम्बर भर में गति में अलग हो जाएगा कि एक घूर्णन प्रवाह पैदा कर रहे हैं कि उल्लेख किया जाना चाहिए. यह स्पष्ट रूप से endothelial कोशिकाओं के लिए प्रवाह के संबंध में और कतरनी तनाव के साथ एक इष्टतम वातावरण नहीं है, लेकिन फिर भी हम स्थिर और repeatable परिणाम उत्पादन एक प्रणाली है. अधिक इष्टतम स्थितियों अशांति के अभाव में लामिना का प्रवाह घूम शामिल होंगे. यह यहाँ का प्रतिनिधित्व मॉडल में, हालांकि, संभव नहीं है और हमारे ज्ञान को एक ऐसी प्रणाली तिथि करने के लिए उपलब्ध नहीं है. , प्रणाली में जोड़ा थक्कारोधी का कोई या निम्न स्तर के साथ पूरे रक्त के साथ गठबंधन करने के लिए संभव नहीं है कि कई microfluidic प्रणालियों उपलब्ध व्यावसायिक तौर पर कर रहे हैं हालांकि, जिससे रक्त और endothelial कोशिकाओं में मौजूद सभी घटकों के बीच बातचीत का उचित संवेदनशील मूल्यांकन सक्षम करने में विफल.इसके अलावा, TNFα स्वतंत्र रूप से रक्त की मात्रा के जैसे की एक दोगुनी गठन के साथ संयोजन में HUVEC सक्रिय करने की दिशा में रक्त कोशिकाओं की भर्ती में एक 2 गुना वृद्धि हुई थी. इस मॉडल प्रणाली की स्थिरता की पुष्टि करता है और भी पूरे रक्त के साथ संयोजन में एक सक्रिय अन्तःचूचुक का उपयोग करने की संभावना को दर्शाता है. , रक्त endothelial सेल चैम्बर विभिन्न स्थितियों और सक्रियण के चरणों के तहत कोशिकाओं पर व्यक्त मार्करों की एक किस्म से सक्रिय endothelial कोशिकाओं की दिशा में रक्त कोशिका भर्ती की जांच के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है पर भविष्य. इसके अलावा, मॉडल भड़काऊ शर्तों पर प्रभाव का मूल्यांकन करने के क्रम में औषधीय एजेंटों के साथ संयोजन में इस्तेमाल किया जा सकता है.
संक्षेप में, हम रोग की प्रासंगिक जांच प्रदर्शन करने के लिए इन विट्रो प्रणाली में एक पूर्ण मानव को बनाने के लिए मानव रक्त और नाड़ी कोशिकाओं के साथ एक कक्ष मॉडल के संयोजन के महान लाभ दिखा.
The authors have nothing to disclose.
इस अध्ययन एन 602699 (direkt) ° अनुदान समझौते के तहत स्वीडिश अनुसंधान परिषद (90293501, A0290401, A0290402), यूरोपीय समुदाय के सातवें फ्रेमवर्क कार्यक्रम से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था, NovoNordisk फाउंडेशन, Gurli और एडवर्ड Brunnberg फाउंडेशन, चिकित्सा, Vleugel स्टेम फाउंडेशन और ake Wiberg फाउंडेशन.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Human Umbilican Vein Endothelial Cells (HUVEC) | PromoCell | C-12200 | Any other type of primary human endothelial cell may be used. |
Endothelial Cell Growth Medium MV (ECGM MV) | PromoCell | C-22120 | |
Gelatin | Sigma-Aldrich | G-2500 | Prepare 1% gelatin in PBS, incubate 5 ml in a T75 for 15 min and remove before culturing cells. |
TAT ELISA | Enzyme Research Lab. | TAT-EIA-C | |
Mouse anti-human CD16 | DAKO | F7011 | Dilution 1:100 |
Goat anti-mouse Alexa 488 | Molecular Probes | A11001 | Dilution 1:500 |
Phalloidin-Texas Red | Molecular Probes | A22287 | Dilution 1:200 |
DAPI | Molecular Probes | D1306 | Dilution 10 μg/ml |
EDTA | Sigma | E-6758 | |
0.25% Trypsin-EDTA | Gibco Life Tecnologies | 25200-056 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco Life Technologies | 10437 | |
1 well cell culture slides | BD Falcon | 354101 | |
Blood Chambers | NA | NA | Blood Chamber may be manufactured in PMMA or any other plastic able to bind CHS |
Clamps | Office Depot | 2052204 | |
Corline Heparin Surface (CHS) | Corline Systems AB | 945-00 | |
Hypodermic needle | Terumo | NN-1850R | Size: 18 G x 5 mm |
Unfractionated Heparin (UFH) | Leo Pharma | 585679 | |
K3EDTA | Alfa Aesar | 1709958 | Prepare a 0.34 M stock solution in milliQ H20 |
PFA | Sigma-Aldrich | P-6148 | |
Fluorescence microscope | Nikon | 80i | |
Light microscope | Nikon | TS100 | |
Image analysis software | Broad Institute | CellProfiler | Available for free at www.cellprofiler.org |