Använda cystisk fibros luftväg som ett exempel, presenterar manuskriptet en omfattande arbetsflöde innefattar en kombination av metagenomic och metatranscriptomic tillvägagångssätt för att karakterisera den mikrobiella och virala samhällen i djurassocierade prover.
Tillgängligheten av hög genomströmning sekvense har revolution många områden av biologin. För att bättre förstå värdassocierad virala och mikrobiella samhällen, var en omfattande arbetsflöde för DNA och RNA-extraktion utvecklas. Arbetsflödet genererar samtidigt virala och mikrobiella metagenomes samt metatranscriptomes, från ett enda prov för nästa generations sekvensering. Kopplingen av dessa metoder ger en översikt över både de taxonomiska egenskaper och samhälls kodade funktioner. De presenterade metoderna använder Cystisk fibros (CF) sputum, en problematisk provtyp, eftersom det är utomordentligt viskös och innehåller höga halter av muciner, fri neutrofil-DNA, och andra okända föroreningar. De protokoll som beskrivs här rikta dessa problem och framgångsrikt återhämta virus och mikrobiell DNA med minimal mänsklig DNA kontamination. För att komplettera metagenomiken studierna gjordes en metatranscriptomics protokoll optimerad för att återvinna både mikrobielloch värd mRNA som innehåller relativt få ribosomalt RNA (rRNA) sekvenser. En översikt av dataegenskaperna presenteras för att tjäna som en referens för att bedöma framgången av metoderna. Ytterligare CF sputumprover ades också in för att (i) utvärdera konsistens av microbiome profiler inom sju dagar i följd inom en enda patient, och (ii) jämför konsistensen av metagenomic förhållningssätt till en 16S ribosom RNA-gen-baserad sekvensering. Resultaten visade att daglig fluktuation av mikrobiella profiler utan antibiotika störning var minimal och taxonomi profilerna för de gemensamma CF-associerade bakterier var mycket likartad mellan 16S rDNA bibliotek och metagenomes genererade från hypotonisk lys (HL) härrörande DNA. Skillnaderna mellan 16S rDNA taxonomiska profiler genereras från totalt DNA och HL-härledda DNA antyder att hypotonisk lys och tvättstegen gynnas inte bara avlägsnande av DNA från människa härledd, men också mikrobiellt härledd extracellular-DNA som kan förvränga det faktiska mikrobiella profilerna.
Virala och mikrobiella samhällen som är förknippade med den mänskliga kroppen har undersökts i stor omfattning under det senaste decenniet genom tillämpning av sekvenseringsteknologier 1,2. Utfallen har lett till erkännande av betydelsen mikroberna i människors hälsa och sjukdom. Den större initiativ kom från den mänskliga microbiome projekt som beskriver bakterierna (och vissa arkéer) bosatt på mänsklig hud, och inom orala håligheter, luftvägar, urogenitala området, och mag-tarmkanalen 3. Ytterligare microbiome studier av friska humana luftvägar genom bronkoalveolär lavage (BAL) 4,5 och nasofarynxpinnar 4 har visat att lungan kan tjäna som en miljöprovtagningsanordning, resulterar i övergående mikrobiell kolonisering i luftvägarna. Däremot kan effekterna av mikrobiell kolonisering i nedsatt luftvägsytor leda till allvarliga och kroniska lunginfektioner, såsom de framgår av cystisk fibros (CF) patienter.
t "> CF är en dödlig genetisk sjukdom som orsakas av mutation i cystisk fibros transmembran regulator (CFTR) gen 6. Dessa mutationer ger upphov till defekta CFTR-proteiner som i sin tur påverkar transepitelial jontransport över det apikala ytan av epitelet. Sjukdomen drabbar flera organsystem, men majoriteten av dödlighet och sjuklighet är hänförlig till CF lungsjukdom 7. CF lungan ger ett unikt ekosystem för mikrobiell kolonisering. Defekten i jontransport orsakar slem att bygga upp i CF luftvägarna, skapar mikromiljöer som består av aerob , mikroaerofila och anaeroba fack förankrad med en statisk näringsrikt slemhinneyta. Denna miljö underlättar kolonisering och spridning av mikrober, inklusive virala, bakterier och svampar. Akuta och kroniska pulmonella mikrobiella infektioner leder till konstanta men ineffektiva immunsvar, vilket resulterar i omfattande luftvägs ombyggnad, förlust av lungkapacitet, och i slutändan pulmonary misslyckande.Bakteriella samhällen som är förknippade med CF lungan har beskrivits väl med båda kulturberoende och kulturoberoende metoder, bland annat med hjälp av 16S ribosomalt RNA (rRNA) genen sekvense 8 och shotgun metagenomik 9,10. 16S rRNA-baserade tillvägagångssätt är i stånd att karakterisera ett brett spektrum av mikrobiella arter och fånga breda förskjutningar i gemenskap mångfald. Det är dock begränsad i sin resolution att definiera de samhällen (sammanfattade i Claesson et al. 2010 11) och förutsägelser metabola potentialer är begränsade till dessa allmänna funktioner kända för taxa identifieras. Därför 16S rRNA genen sekvenseringsmetoder är otillräckliga för den nödvändiga taxonomiska och funktionell analytisk noggrannhet de olika mikrobiella samhällen som finns i CF lungorna. Den metagenomic tillvägagångssätt beskrivs här kompletterar 16S rRNA synsätt, övervinner sina begränsningar, och möjliggör ett relativt effektivt sättatt analysera både den mikrobiella taxonomi och genetiska innehållet i CF lungorna.
Mikrobiell DNA isolerat från animaliska associerade prover innehåller ofta en stor mängd värd-DNA. CF sputum eller lungvävnadsprover innehåller vanligtvis en stor mängd mänskligt DNA släpptes av neutrofiler i immunsvaret, ofta mer än 99% av den totala DNA 12-14. Även om vissa intakta humana celler kan vara närvarande, är det mesta av detta DNA-fria i lösning eller adsorberas till ytan av mikrober. Dessutom närvaron av exceptionellt viskösa slemproppar, cellrester och andra okända föroreningar ytterligare komplicera isolering av mikrobiella celler. Flera metoder testades för att tömma dessa prover av humant DNA, inklusive Percoll-gradienter för att separera humana från mikrobiella celler 15, behandling med DNas I, etidiumbromid monoazide att selektivt nedbryta humant DNA 16 och MolYsis satsen, alla med begränsad framgång. Hittills har mest effektiv mikrobiell DNA förfarande för CF-sputum rening har varit en modifiering av förfarandet beskrivet av Breitenstein et al. (1995) 17. Detta tillvägagångssätt, häri känt som hypotonisk lys (HL) metoden, använder en kombination av β-merkaptoetanol för att minska mucin disulfidbindningar, hypotonisk lys av eukaryota celler, och DNas I-behandling av lösligt DNA 9. Trots bristen på alternativ HL metoden väckt vissa farhågor på grund av (i) eventuella fördomar till följd av oönskad lys av mikrober och (ii) om de observerade fluktuationer i samhällets sammansättning 9,10 är en artefakt av variationer i samband med provbearbetning. Förutom alstringen av shotgun metagenomes, vi itu med dessa frågor genom att jämföra 16S rRNA-genen profiler av det totala DNA och mikrobiell extraheras DNA från HL-metoden med användning av samma uppsättning av sputumprover uppsamlade från en enda patient över sju dagar i följd.
ent "> Jämfört med mikrobiella samhällen, är karakterisering av virus samhällen förknippas med djur begränsad 18,19 De virala samhällena i CF airways har endast karakteriseras minimalt 20 -.. 22 Den första metagenomic studien karakterisera DNA av virus samhällen i CF airways visade att de flesta virus förknippade med CF lungorna är fager 20. Den metaboliska potential fag i CF och icke-CF individer var signifikant olika. Specifikt fag samhällen i CF individer genom gener reflekterande av bakteriella värd anpassningar fysiologi CF luftvägar, och bakteriella virulens 20. Efterföljande metagenomic studier av virus i CF lungvävnad visade distinkt rumslig heterogenitet av virala samhällen mellan anatomiska regioner 22. Dessutom CF lungvävnad hyste lägsta viral mångfald observerats hittills i alla ekosystem 22. De flesta virus identifierade var fagermed potential att infektera CF patogener. Men eukaryota virus såsom herpesvirus, adenovirus och humana papillomvirus (HPV) har också upptäckts. I ett fall där cystor i lungvävnaden observerades under dissektion, var mer än 99% av ett humant papillomvirus genomet återvinns, trots att patienten aldrig diagnostiserats med en lung papillom eller carcinom. Detta indikerar att den virala mångfalden närvarande inte bara återspeglar hur allvarlig vävnadsskada, men kan också avslöja och förklara en underliggande okaraktäriserat sjukdom. De protokoll som beskrivs här ger ett enkelt, men ändå kraftfullt sätt att isolera viruslika partiklar (VLP) från prov som består av stora mängder tjockt slem, värd och mikrobiella celler, fritt DNA, såväl som cellrester.Komplement metagenomik är metatranscriptomics används för att övervaka dynamiken i genuttryck över mikrobiella och värd 9,23. I det här fallet, både mikrobiellt och HOSt-mRNA måste företrädesvis väljas. Eftersom bakterie mRNA inte polyadenyleras, kan en oligo-dT-baserade mRNA rullgardins metoden inte utnyttjas. Polyadenylering-beroende RNA-förstärkning kan inte användas i värdassocierade prover om provtagningen är kända för att innehålla stora mängder eukaryot mRNA. Många djurrelaterade prover, inklusive CF slem, innehåller en hög täthet av celler förutom stora mängder cellrester och nukleaser som inkluderar RNaser. Därför är en annan utmaning för att förhindra omfattande RNA nedbrytning under metatranscriptome bearbetningen. I de flesta fall är total RNA extraherat från CF slem delvis försämrad, begränsar nedströms applikationer och verktyg för den härledda RNA. Under senare år har flera metoder för rRNA utarmning utvecklats och anpassats i kommersiellt tillgängliga kit. Effekten av dessa metoder är dock begränsad, speciellt vid arbete med delvis försämrad rRNA 9,24. De metoder som används här tillåtered för hämtning av delvis nedbrutet totalt RNA lämpligt för effektiv nedströms totala rRNA borttagning. Direkt jämförelse av effektiviteten i rRNA avlägsnande från delvis försämrat total RNA jämföra två olika satser illustrerades av Lim et al. (2012) 9.
Sammantaget är målet för detta manuskript för att ge en komplett uppsättning protokoll (Figur 1) för att generera virala och mikrobiella hagelgevär metagenomes, och en metatranscriptome, från ett enda djur associerad prov, med hjälp av inducerat sputum provet som ett exempel. Molekylär laboratorium arbetsflöde bör omfatta separata för- och efterförstärkningsområden för att minimera korskontaminering. Metoderna är lätt att anpassa till andra provtyper såsom vävnads 22, nasofaryngeal och svalg 25, bronkoalveolärt lavage (BAL) och korall (opublicerade data). Varje prov bör behandlas omedelbart efter samlingen speciellt när mikrobiella metagenomik och träffadeatranscriptomics studier önskas. Om proverna frystes, begränsar det isolering av intakta mikrobiella celler för mikrobiella metagenomes som frysning potentiellt störa cellernas integritet. Däremot frysning inte utesluta metatranscriptomics och viral isolering, men kvaliteten på RNA och mängden av viruspartiklar återvunna kan påverkas genom frys-tö process. Det är viktigt att notera att inducerad sputum har fungerat som den primära källan av prover i många studier i samband med vuxna CF-patienter och andra kroniska lungsjukdomar 26,27 som BAL kan vara för invasiva. I våra studier var sputumprover samlas med en noggrann och konsekvent provtagningsmetod, dvs efter munvatten och sköljning av munhålan med steril koksaltlösning för att hålla muntliga mikrober förorening inom sputumprover till ett minimum.
Virala metagenomiken
Viruspartiklar är koncentrerade använder polyetylenglykol (PEG) utfällning eller små volym koncentratorer. I vissa fall kan koncentrationen inte behövas, men pre-filtrering eller låghastighetscentrifugering steg används för att avlägsna eukaryota och mikrobiella celler. Viral lysat kommer ytterligare berikas och renas med hjälp av densitetsgradient ultracentrifuge 9,41 eller mindre storlek filter (t.ex. 0,45 pm) för att ta bort eukaryota och stora mikrobiella celler 25. Densitetsgradient-ultracentrifugering utförs typiskt med täta men inerta lösningar såsom sackaros eller cesium-klorid för att isolera och koncentrera virala partiklar 41. Fysisk separering är baserad på storleken och flytdensitet av virala partiklar. Därför lämpligt val av filter porstorlek och den rigorösa framställning av gradienter är väsentliga för att isolera specifika virala samhällen, eftersom framgången för fysiska återhämtningVLP bestämmer samhället isolerade 41 (dvs viruspartiklar som inte passerar genom filtret eller faller inom utvinning tätheten kommer inte upptäckas i metagenome). Efter viral isolering och koncentration, kan det finnas kontaminerande icke-viralt genomiskt material som är närvarande i provet, både i form av fria nukleinsyror och mikrobiell och eukaryota celler. Därför, är det kritiskt att kontrollera renheten av virala partiklar i prover (figurerna 1A och 1B). En kloroformlösning behandling är vanligen används för att lysera återstående cellerna, följt av nukleasbehandling att nedbryta fria nukleinsyror före nukleinsyra extraktion.
En varning till den presenterade arbetsflödet var användningen av densitetsgradienten separation för att isolera viruspartiklar som det kan utesluta omhöljda viruspartiklar som kan vara för stark för att komma in i CsCl lutning. Ett alternativ "catch-all" metod är att utelämna densitetsgradienten separation och isolera samhället DNA från de 0,45 um – filtrat behandlades med kloroform och DNas I. Detta tillvägagångssätt är också lämpligt att rymma små provvolymer som de från Toppar eller blodplasma. Detta kan dock resultera i kloroform resistenta bakteriekontamination och högre mängd DNas I-resistenta extracellulärt DNA.
Aktuella sekvense protokoll kräver 1 ng till 1 pg av nukleinsyror för förberedelse sekvense bibliotek vari högre DNA avkastning ger ett större utbud av sekvense alternativ. Den DNA-koncentration av genererade viromes varierar ofta från under detektionsgränsen till mer än 200 ng / l. Mängden av virala nukleinsyror återvunna kan vara otillräckligt för direkt sekvensebiblioteks förberedelser. I sådana fall är nukleinsyraamplifiering väsentlig. Linker förstärknings hagelgevär bibliotek (LASLs) 2,42,43 och hela genomet förstärkning baserad på flera förskjutningsförstärkning (MDA) är de tvåmetoder som används oftast för att generera tillräckligt med DNA för sekvensering. MDA metoder såsom de som baseras på Phi29 DNA-polymeras är kända för att lida av förstärknings fördomar, och kan företrädesvis förstärka ssDNA och cirkulärt DNA, vilket resulterar i icke-kvantitativa taxonomiska och funktionell karakterisering 44,45. En optimerad version av LASLs tillvägagångssätt har visat att införa endast minimala fördomar, främjar högre känslighet (för små mängder av utgångsmaterial), och är lätt anpassas för olika sekvense plattformar 43. Emellertid har det tillvägagångssätt många steg, kräver specialiserad utrustning för att minimera DNA-förlust, och är begränsad till dsDNA mallar. I vårt laboratorium, har detta tillvägagångssätt varit framgångsrikt anpassat att förstärka detekterbara och omätbara mängd DNA extraherat från bronkoalveolär lavage-, coral- och havsvatten-härledda VLP (opublicerade och et al. Hurwitz 46).
Utveckla dataanalys rörledningar har classically varit en av de mest utmanande aspekterna av viral metagenomik analys på grund av den mycket skiftande och till stor del okända arten av de virala samhällen. Även om det finns uppskattningsvis 10 8 virala genotyper i biosfären hittills nuvarande virusdatabaser innehåller ~ 4000 virala genom, vilket är ungefär 1 / 100.000: i denna ungefärliga totala viral mångfald. Därför likhet baserade sökningar (t.ex. BLAST 47) för taxonomiska och funktionell uppdrag i virus metagenomes besitter inneboende utmaningar. Många sekvenser inte har betydande likheter med genomen i databasen, och därför klassificeras som okända. Även om homologisbaserade sökningar är de viktigaste applikationer för att tilldela taxonomi och funktion för att sekvensdata, har alternativa metoder baserade på databas-oberoende analys utvecklats 48- 50. Fancello et al., 51 ger en fullständig översyn av beräkningsverktyg och algoritmer som används i viral metagenomiken.
Mikrobiell metagenomiken
Typiskt, den totala mängden DNA som extraherats från hypotona lys behandlade mikrobiella samhällen (HL-DNA) sträcker sig från 20 ng till 5 mikrogram. Utbytet är i hög grad beroende på patientens hälsotillstånd och mängden upphostningsprov uppsamlades, vilket förklarar variationerna som ses i det totala utbytet av HL-DNA som extraherats i denna studie (tabell 2). De kritiska steg att generera sekvensdata av god kvalitet är beroende av kvaliteten på sekvensebibliotek genereras. Figur 2 visar en typisk storleksintervall för sekvense biblioteken genererade från CF slem-härledda mikrobiell DNA med hjälp av en enzymatisk-baserad DNA fragmentering förfarande. Den optimala biblioteksstorleken beror på valet av sekvense plattform och tillämpning, och därför kan det fragmenteförfarandet optimeras, om nödvändigt, genom alternativa metoder såsom ultraljudsbehandling och nebulisering. Förutomde presenterade representativa resultat, är framgången för den presenterade metoden på CF slem samlas in från flera patienter över flera tidpunkter illustreras också i Lim et al. (2012) 9 och Lim et al. (2014) 10.
Tidigare studier 9,10 tyder på att varje patient hyser en unik uppsättning av mikrobiell gemenskap som skiftar över tiden, vilket återspeglar uthållighet av de större aktörerna i samhället medan fluktuationer är sannolikt på grund av störningar såsom antibiotikabehandlingar. Huruvida dessa fluktuationer sker dagligen även utan yttre störningar eller på grund av provtagningsförfarandet och provbearbetning, är fortfarande i fråga. Baserat på HL-DNA metagenomic och 16S rDNA amplikon analys, visar 7-dagars längd provtagning att den dagliga fluktuationer i mikrobiella profiler utan antibiotika störning (Dag 1, 2, och 3) var minimala (Figur 3A och 3B). Upon introproduktion av orala antibiotika direkt efter Dag 3 provtagning, förändringar i samhället profilen blev uppenbart på dag 4. Medan antibiotikumet ciprofloxacin riktar ett brett spektrum av kända bakteriella patogener såsom P. aeruginosa, Staphylococcus aureus och Streptococcus pneumonia, ökade behandlingen den relativa förekomsten av P. aeruginosa samtidigt minska Streptococcus spp. och P. melaninogenica. Genom Dag 6, samhället återhämtade långsamt till den ursprungliga startsamhällsstruktur. Resultaten tyder på att fluktuationer i mikrobiella profiler inom en enda patient är mer sannolikt på grund av samhälls störningar i luftvägarna.
Med tanke på överensstämmelse mellan de mikrobiella profiler av 16S rDNA bibliotek och metagenomes från HL-härledda DNA, vi uteslutit de fördomar som härrör från 16S rRNA primers som används i denna studie. En möjlig förklaring till skillnaderna ses över 16S rDNA taxonomiskal-profiler som genereras från total DNA och HL-härledda DNA (Figur 3B) kan vara förekomsten av höga halter av Pseudomonas spp. extracellulärt DNA efter antibiotikabehandling. Detta stöds av resultaten att dessa skillnader var mest uppenbara vid Dag 7, tre dagar efter antibiotikabehandling, som riktar Pseudomonas spp. utöver andra. Ciprofloxacin används ofta som den första linjens behandling av patienter med CF och kronisk P. aeruginosa-infektion även om dess aktivitetsspektrum omfattar de flesta CF-associerade patogener. Vi antog att den antibiotikabehandling utrotar mottagliga samhällen inklusive Streptococcus spp. och därmed skapa en nisch fylld av resistenta P. aeruginosa. Pseudomonas aeruginosa kan få motståndet genom att öka sina biofilm samhällen och extracellulärt DNA har visat sig vara den viktigaste strukturella stöd för sin biofilm arkitektur 52. Även som tHan återhämtade samhällsstrukturen, extracellulärt DNA kan ha kvar i CF slem. Därför är dessa data tyder på att hypoton lysering och tvättsteg som presenteras i detta arbetsflöde potentiellt gynnas inte bara ta bort DNA humanhärrörande, men också mikrobiell härledda extracellulärt DNA som kan förvränga den verkliga mikrobiella profilerna.
Metatranscriptomics
En hög kvalitet metatranscriptome bör innehålla relativt få ribosom RNA (rRNA) sekvenser och representerar en opartisk provtagning av de gemensamma avskrifter (mRNA). På grund av den korta halveringstiden och begränsad mängd mRNA, är det viktigt att protokollet, som presenteras här, minimerar provhantering för att maximera antalet utskrifter återvunna.
Under senare år har flera metoder för rRNA utarmning utvecklats och anpassats i kommersiellt tillgängliga kit. Dessa inkluderar Microb Enrich, Ribo-Zero, och prov specifik subtraktiv hybridizations 53 som är baserade på oligonukleotidhybridisering, och mRNA-ONLY kit som bygger på exonukleas enzymatisk aktivitet targeting RNA innehållande en 5 'monofosfat. Dessutom har flera metoder för mRNA anrik såsom MessageAmp II-Bakterier Kit som företrädesvis polyadenylates och förstärker linjärt RNA finns också. Vissa av dessa metoder (t.ex. mRNA-ONLY, Microb E xpress och MessageAmp) används samtidigt för optimal effektivitet. Men effekten av alla dessa metoder begränsad, speciellt vid arbete med delvis försämrad rRNA, som ofta observeras i totalt RNA extraherat från CF prover. Polyadenylering-beroende RNA-amplifiering kan inte användas för att generera metatranscriptomes bestående av både eukaryot och prokaryot mRNA. Dessutom, poly (A) svansen sattes till sekvenserna får reducerar mängden användbara sekvensdata. Regioner med homo sträckor tenderar att ha lägre kvalitetsresultat, causing ett betydande antal läser som ska filtreras genom sekvensering och eftersekvense mjukvara, och den genomsnittliga nyttjande lästa längd efter trimning av poly (A) svansar kommer att minska avsevärt 54.
Att handskas med komplexa CF mikrobiella samhällen och delvis försämrat RNA (figur 4A och 4C), visade vår tidigare studie att hybridisering-fångstmetod av Ribo-Zero Gold kit var effektivare i att ta bort både mänskliga och mikrobiell rRNA jämfört med de kombinerar behandlingar med andra kit 9 (tabell 3). Den resulte uppgifter möjliggör samtidig analys av både mänsklig värd och mikrobiella avskrifter. Beroende på avkastning och kvalitet av RNA, liksom ultimata valet av sekvense plattform, många av dessa processer, inklusive cDNA syntessteget kan effektiviseras med sekvensebiblioteksgenerering. Till exempel kan Ribo-Zero behandlat RNA användas för att göra metatranscriptome sekvense librarier använder ScriptSeq RNA-Seq Library Förberedelser kit.
Metagenomic analys av djurrelaterade samhällen ger en övergripande presentation av det övergripande funktionell enhet som innehåller värden och dess tillhörande samhällen. Arbetsflödet som presenteras här är anpassningsbara till en mängd komplexa djurassocierade prover, speciellt de som innehåller tjockt slem, höga mängder av celldebris, extracellulär DNA, protein och glykoprotein-komplex, såväl som värdceller i tillägg till den önskade virala och mikrobiella partiklar. Även om virala och mikrobiella partiklar kan förloras vid varje steg, partiklar isolering och rening är viktigt att minimera mängden av värd-DNA. Medan uppgifterna metagenomik ger metabola potentialer hos de undersökta samhällen, metatranscriptomics komplettera detta genom att avslöja differentialuttryck av kodade funktioner 9. En omfattande utvärdering av genomik och avskrifter data har gett nya insights till dynamiken i samhällsinteraktioner och underlättar utvecklingen av förbättrade terapier 9,10,55.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av National Institute of Health (1 R01 GM095384-01) delas Forest Rohwer. Vi tackar Epicentrum, ett Illumina bolag för att ge tidig tillgång till Ribo-Zero Epidemiologi kit. Vi tackar Mark Hatay för design och produktion av ultracentrifugeröret innehavaren. Vi tackar Andreas Haas och Benjamin Knowles för kritiska läsningar och diskussioner av manuskriptet, och Lauren Paul för att bistå filmandet processen.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Guanidine isothiocyanate-based RNA lysis buffer | Life Technologies | 10296-028 | TRIzol LS Reagent was used in this study |
Silica beads; 0.1 to 0.15 mm | Cole-Parmer | YO-36270-62 | Zirconia-Silicate Beads were used in this study |
Dithiothreitol Molecular Grade (Dry Powder) | Promega | V3155 | Can be purchased from any other company |
Sterile syringe filter; 0.45 µm pore size hydrophilic PVDF membrane | Millipore | SLHV033RS | |
DNase I enzyme | Calbiochem | 260913 | |
Sterile syringe filter; 0.02 µm pore size | FisherScientific | 09-926-13 | Diameter: 25mm |
Ultra-Clear Centrifuge Tubes | Beckman | 344059 | 9/16 X 3 ½ in. (14X90mm), suitable for SW41 Ti Rotor and VLPs density gradient ultracentrifugation |
SW41 Ti Rotor | Beckman | 333790 | |
SS-34 Fixed Angle Rotor | Thermo Scientific | 28020 | |
Phi29 DNA polymerase | Monserate Biotech | 4001 | 10 U/µl |
Phi29 Random Hexamer | Thermo Scientific | S0181 | Previously bought from Fidelity Systems |
Alumina matrix filter with annular polypropylene support ring; 0.02 µm pore size | FisherScientific | 09-926-34 | Whatman Anodisc Filter Membranes were used in this study; Diameter 25mm |
SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain | Life Technologies | S-11494 | |
2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250-100ML | |
RNase-free DNase I | NEB | M0303S | Can be purchased from any other company |
Glycogen, RNA grade | FisherScientific | FERR0551 | Can be purchased from any other company |
Oak Ridge high-speed centrifuge tubes | FisherScientific | 05-562-16B | For large volume DNA extraction procedure, suitable for SS-34 fixed-angle rotor |
Total rRNA removal kit | Epicentre | MRZE724 | ScriptSeq Complete Gold Kit (Epidemiology) can be used to couple rRNA removal with sequencing library preparation |
Cesium chloride | FisherScientific | BP1595-500 | |
Hexadecytrimethyl-ammonium bromide (CTAB) | Sigma-Aldrich | H5882-100G |