CRISPR/Cas9 is a robust system to produce disruption of genes and genetic elements. Here we describe a protocol for the efficient creation of genomic deletions in mammalian cell lines using CRISPR/Cas9.
The prokaryotic clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) 9 system may be re-purposed for site-specific eukaryotic genome engineering. CRISPR/Cas9 is an inexpensive, facile, and efficient genome editing tool that allows genetic perturbation of genes and genetic elements. Here we present a simple methodology for CRISPR design, cloning, and delivery for the production of genomic deletions. In addition, we describe techniques for deletion, identification, and characterization. This strategy relies on cellular delivery of a pair of chimeric single guide RNAs (sgRNAs) to create two double strand breaks (DSBs) at a locus in order to delete the intervening DNA segment by non-homologous end joining (NHEJ) repair. Deletions have potential advantages as compared to single-site small indels given the efficiency of biallelic modification, ease of rapid identification by PCR, predictability of loss-of-function, and utility for the study of non-coding elements. This approach can be used for efficient loss-of-function studies of genes and genetic elements in mammalian cell lines.
Recent advances in genome engineering technology have allowed for unprecedented opportunities for site-specific modification of the genome. This technology may be utilized to investigate the function of genes and regulatory elements via prospective genetic perturbation. Zinc finger nucleases (ZFNs), transcription-activator like (TAL) effector nucleases (TALENs), and CRISPR/Cas9 RNA-guided nucleases each leverage customizable DNA specificity to localize a nuclease for the introduction of DSBs1–3. The resulting DSBs can be repaired by indel-forming NHEJ or by homology-directed repair (HDR) using a donor template4.
The CRISPR/Cas9 nuclease pathway, an adaptive immune system in prokaryotic cells5, has been recently adapted for mammalian genome engineering2,3. This tool has been demonstrated to be an inexpensive, efficient, and reliable genome engineering technique6. Briefly, a complex of Streptococcus pyogenes-derived Cas9 nuclease and a sgRNA achieve target recognition via Watson-Crick base-pairing with cognate genomic DNA sequences. sgRNAs include 20-mer sequences complementary to genomic sequences adjacent to an obligate protospacer adjacent motif (PAM) NGG. Cas9 induces a DSB at a predictable position within the target site. Additionally, variants of Cas9 with single-strand cleavage capacity or catalytic inactivity may be used to facilitate “nicking” or transcriptional regulation respectively7–9. CRISPR/Cas9 has been used for a wide range of applications including both knock-in and knockout10,11, large-scale genomic deletions12–14, pooled library screening for gene discovery15,16, genetic engineering of numerous model organisms10,11,17–21, as well as gene therapy22,23.
Here we describe a protocol for efficient deletion of desired genomic regions. The protocol includes CRISPR design, cloning, and delivery, as well as deletion, identification, and characterization. Genomic deletions can be generated by the introduction of two CRISPR sgRNAs with Cas9 to induce repair of the resultant two DSBs by NHEJ with deletion of the intervening segment. This strategy has been used to create deletions ranging from one kilobase to over one megabase12. Deletions can be informative for the study of genes and other genetic elements, either in isolation or in combination. There are several potential advantages of genomic deletions as compared to HDR or single-site small indel production. First, this method capitalizes on the high efficiency of NHEJ in many cellular contexts7. The high frequency of deletion limits the number of clones needed to be screened to identify informative clones. Deletion frequency is inversely related to deletion size. Biallelic deletion clones may be retrieved at frequencies at least as great as of probabilistic expectation12. Second, both monoallelic and biallelic deletions may be easily identified and distinguished by conventional PCR, simplifying the screening process. Strategies relying on small indels or point mutations may require RFLP, allele-specific PCR, T7EN1 cleavage assay, Sanger sequencing, RT-qPCR, or immunoblotting, which may be more laborious. Third, by removing a substantial portion of a gene or element of interest, a reliable loss-of-function allele may be obtained. In contrast, frameshift mutations in protein-coding sequences may not always induce nonsense-mediated decay, may produce a hypomorphic or neomorphic allele, or target an exon excluded from an alternate isoform24. Finally, deletions may be particularly revealing for the study of non-coding DNA such as regulatory elements since frameshift mutations as produced by single-site indels would not be relevant25.
Den CRISPR / Cas9 systemet kan brukes til å generere genomisk slettinger av en rekke størrelser. Selv om vi har observert at hyppigheten av sletting varierer omvendt i forhold til beregnet sletting størrelse, har vi vært i stand til å gjenopprette slettinger på opp til 1 Mb, og slettinger opp til 100 kb rutinemessig gi flere biallelic slettet kloner. Vi har observert noe tap i virkningsgrad på sekvensmessig innføring av delesjoner i en cellelinje. Denne strategi kan anvendes for opprettelse av kombinatorisk delesjon av tallrike gener og elementer. Prosessen med å skaffe bialleliske delesjonskloner kan bli fremskyndet ved å beregne minimum antall kloner som trengs for å være skjermet basert på sletting størrelse for å oppnå det ønskede antall kloner med bialleliske sletting 12.
Muligheten til å skaffe monoallelic sletting med fravær av biallelic sletting ved sannsynlighetsfordeling kan indikere celle dødelighet assosiert med fullstendig tap av funksjon. Lav frfrekvensskiftnøklede eller fraværende slettinger kan reflektere en rekke scenarier, inkludert dårlig transfeksjon, ineffektive sgRNAs eller ineffektive PCR screening primere (på grunn av mangel på en positiv kontroll for å validere PCR primere til skjermen for sletting). GFP + celler kan brukes som et surrogat for transfeksjonseffektivitet (se trinn 5.2), slik at en reduksjon i GFP + celler sannsynligvis skyldes dårlig transfeksjon og en resulterende redusert sletting effektivitet. Ved hjelp av to ulike sgRNA parene med uavhengige screening primere kan hjelpe kontroll for ineffektiv sgRNA og screening PCR primere og maksimere sjansene for å få biallelic sletting kloner. Celle sortering for GFP + celler beriker for sletting alleler. Selv om dette trinn kan utelates, vil utelatelsen sannsynlig nødvendig screening flere kloner for å identifisere de med monoallelic eller bialleliske delesjoner. I den grad transfeksjonseffektivitet kan optimaliseres, ville vi forvente genom redigering effektivitet for å bli styrket.
<p class = "jove_content"> De NHEJ hendelser som ligger til grunn slettinger og lokal reparasjon resultat i en serie av alleler med en rekke indels på målwebområder. Den dominerende utfallet er små ~ 1-10 bp innsett eller mer vanlig slettinger på stedet av sgRNA-rettet cleavage (figur 2B). Ofte er disse alleler synes å være et resultat av microhomology basert reparasjons 34,35. Det skal bemerkes at PCR-basert deteksjon strategi beskriver vi ikke vil identifisere større og mer kompliserte insersjoner, delesjoner, inversjoner eller rearrangementer. Selv om disse hendelsene er mindre vanlig, har vi observert kloner der verken sletting eller ikke-sletting amplikonene kunne påvises, og ved nærmere undersøkelse gjenspeile disse mer komplekse utfall.Vi har observert utstrakt CRISPR / Cas9-mediert "scarring" av ikke-delesjons alleler fra monoallelic og ikke-delesjonskloner (se figur 2B). Disse "arr" består avsmå indels produsert ved sgRNA spaltingssete uten den tilsiktede delesjon (det vil si, delesjon av den mellomliggende segment mellom sgRNAs A og B). Disse arrene avbryte ofte målet anerkjennelse av sgRNA. Derfor vil vi oppfordre forsiktig i retargeting alleler i cellene tidligere utsatt for sgRNAs bruker de samme sgRNAs. En mer vellykket retargeting strategi ville utnytte unike sgRNA sekvenser forskjellig fra tidligere "arrete" gjenkjenningsseter. I tilfeller hvor et par av sgRNAs gjenkjenner exonic sekvenser (figur 1B, nederst), kan rammeskiftlene fremstilles selv i fravær av delesjon. Derfor kan monoallelic delesjonskloner anrikes for tap-av-funksjon på grunn av den høye frekvensen av rammeskiftmutasjoner på den ikke-slettede 12 allelet.
En bekymring med CRISPR / Cas9 systemet er off-target effekter, dvs. genomisk modifikasjon ved utilsiktede nettsider 36-38. Recent rapporter har antydet at kortere lede RNA med 17 – 19 nukleotider kan redusere hyppigheten av CRISPR / Cas9-basert off-target effekter 39. I tillegg kan en dobbel-sammenpressing strategi ved hjelp av to guider per målområde med en nickase brukes til å lage DSB sin samtidig som off-target effekter 7. Alternativt, som er analog med strategier benyttes for RNAi, foreslår vi at forskjellige par av sgRNAs med ikke-overlappende protospacer sekvenser brukes for å vise at den observerte fenotype er et resultat av den på-target CRISPR / Cas9 modifikasjon i motsetning til et potensial off-target effekt. En praktisk tilnærming ville være å utforme i det minste to nærliggende, men ikke-overlappende sgRNA parvis, slik at et enkelt sett av primere screening (se trinn 2) kan benyttes for flere sgRNA parene (figur 1A). Videre kan utfyller en sletting cellelinje ved å gjeninnføre den manglende delen og / eller forstyrret genet bygge en årsakssammenheng mellomen gitt genomisk sletting og fenotype.
For biologer som arbeider med mobilnettet modellsystemer, har RNAi representert et kraftig verktøy for funksjonell genomforskning. Men begrensninger av denne tilnærmingen har tatt ufullstendig reduksjon i mål mRNA transkripsjonsnivåer, heterogenitet av effekten av uavhengige reagenser rettet mot samme genet, og kjente off-target effekter inkludert frø baserte og ikke-seedet effekter 40-42. Genome redigering strategier lover å møte mange av disse bekymringene og representerer en spennende, komplementær tilnærming for potensiell genetisk forstyrrelse 8,36,37. Videre kan genomet redigering for studiet av ikke-kodende genetiske elementer på en måte som ikke er mulig ved RNAi og utfordrende ved konvensjonell målretting nærmer seg 25. Vi oppfordrer generasjon av genomisk slettinger av CRISPR / Cas9 som en robust og bestemt metode for å produsere og karakterisere tap-av-funksjon alleler.
The authors have nothing to disclose.
Thanks to Jason Wright for suggesting the Golden Gate Assembly cloning strategy and Katherine Helming and members of Orkin lab, particularly Jian Xu, Guoji Guo, Elenoe Smith, and Partha Das for helpful discussions. This work was supported by NIH R01HL032259 and P30DK049216 (Center of Excellence in Molecular Hematology) to S.H.O. and NIDDK K08DK093705 to D.E.B.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
T4 Polynucleotide Kinase | New England Biolabs | M0201S | |
T4 DNA Ligase (with associated ligation buffer) | New England Biolabs | M0202T | |
Adenosine 5'-Triphosphate (ATP) | New England Biolabs | P0756S | |
BSA, Molecular Biology Grade | New England Biolabs | B9000S | |
BbsI Restriction Enzyme (with associated NEB Buffer 2.1) | New England Biolabs | R0539S | |
pSpCas9(BB) (pX330) | Addgene | 42230 | |
S.O.C. Medium | Life Technologies | 15544-034 | |
BTX ECM 830 | Harvard Apparatus | 45-0052 | |
BTX Solution and 2mm Cuvettes | Harvard Apparatus | 45-0803 | |
pmaxGFP Plasmid | Lonza | VPA-1003 | |
QuickExtract DNA Extraction Solution | Epicentre | QE09050 | |
HotStarTaq PCR Master Mix Kit | Qiagen | 203443 | |
Zero Blunt PCR Cloning Kit | Life Technologies | K2700-20 |