CRISPR/Cas9 is a robust system to produce disruption of genes and genetic elements. Here we describe a protocol for the efficient creation of genomic deletions in mammalian cell lines using CRISPR/Cas9.
The prokaryotic clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) 9 system may be re-purposed for site-specific eukaryotic genome engineering. CRISPR/Cas9 is an inexpensive, facile, and efficient genome editing tool that allows genetic perturbation of genes and genetic elements. Here we present a simple methodology for CRISPR design, cloning, and delivery for the production of genomic deletions. In addition, we describe techniques for deletion, identification, and characterization. This strategy relies on cellular delivery of a pair of chimeric single guide RNAs (sgRNAs) to create two double strand breaks (DSBs) at a locus in order to delete the intervening DNA segment by non-homologous end joining (NHEJ) repair. Deletions have potential advantages as compared to single-site small indels given the efficiency of biallelic modification, ease of rapid identification by PCR, predictability of loss-of-function, and utility for the study of non-coding elements. This approach can be used for efficient loss-of-function studies of genes and genetic elements in mammalian cell lines.
Recent advances in genome engineering technology have allowed for unprecedented opportunities for site-specific modification of the genome. This technology may be utilized to investigate the function of genes and regulatory elements via prospective genetic perturbation. Zinc finger nucleases (ZFNs), transcription-activator like (TAL) effector nucleases (TALENs), and CRISPR/Cas9 RNA-guided nucleases each leverage customizable DNA specificity to localize a nuclease for the introduction of DSBs1–3. The resulting DSBs can be repaired by indel-forming NHEJ or by homology-directed repair (HDR) using a donor template4.
The CRISPR/Cas9 nuclease pathway, an adaptive immune system in prokaryotic cells5, has been recently adapted for mammalian genome engineering2,3. This tool has been demonstrated to be an inexpensive, efficient, and reliable genome engineering technique6. Briefly, a complex of Streptococcus pyogenes-derived Cas9 nuclease and a sgRNA achieve target recognition via Watson-Crick base-pairing with cognate genomic DNA sequences. sgRNAs include 20-mer sequences complementary to genomic sequences adjacent to an obligate protospacer adjacent motif (PAM) NGG. Cas9 induces a DSB at a predictable position within the target site. Additionally, variants of Cas9 with single-strand cleavage capacity or catalytic inactivity may be used to facilitate “nicking” or transcriptional regulation respectively7–9. CRISPR/Cas9 has been used for a wide range of applications including both knock-in and knockout10,11, large-scale genomic deletions12–14, pooled library screening for gene discovery15,16, genetic engineering of numerous model organisms10,11,17–21, as well as gene therapy22,23.
Here we describe a protocol for efficient deletion of desired genomic regions. The protocol includes CRISPR design, cloning, and delivery, as well as deletion, identification, and characterization. Genomic deletions can be generated by the introduction of two CRISPR sgRNAs with Cas9 to induce repair of the resultant two DSBs by NHEJ with deletion of the intervening segment. This strategy has been used to create deletions ranging from one kilobase to over one megabase12. Deletions can be informative for the study of genes and other genetic elements, either in isolation or in combination. There are several potential advantages of genomic deletions as compared to HDR or single-site small indel production. First, this method capitalizes on the high efficiency of NHEJ in many cellular contexts7. The high frequency of deletion limits the number of clones needed to be screened to identify informative clones. Deletion frequency is inversely related to deletion size. Biallelic deletion clones may be retrieved at frequencies at least as great as of probabilistic expectation12. Second, both monoallelic and biallelic deletions may be easily identified and distinguished by conventional PCR, simplifying the screening process. Strategies relying on small indels or point mutations may require RFLP, allele-specific PCR, T7EN1 cleavage assay, Sanger sequencing, RT-qPCR, or immunoblotting, which may be more laborious. Third, by removing a substantial portion of a gene or element of interest, a reliable loss-of-function allele may be obtained. In contrast, frameshift mutations in protein-coding sequences may not always induce nonsense-mediated decay, may produce a hypomorphic or neomorphic allele, or target an exon excluded from an alternate isoform24. Finally, deletions may be particularly revealing for the study of non-coding DNA such as regulatory elements since frameshift mutations as produced by single-site indels would not be relevant25.
وكريسبر / نظام Cas9 يمكن استخدامها لتوليد الحذف الجينومية من مجموعة واسعة من الأحجام. على الرغم من أننا لاحظنا أن وتيرة حذف يختلف عكسيا فيما يتعلق يقصد حجم الحذف، وكنا قادرين على استعادة الحذف تصل إلى 1 ميغابايت، والحذف تصل إلى 100 كيلو بايت تسفر بشكل روتيني متعددة biallelic حذف الحيوانات المستنسخة. وقد لاحظنا أي خسارة في كفاءة الحذف إدخال بالتتابع في خط الخلية. هذه الاستراتيجية يمكن استخدامها لإنشاء حذف اندماجي العديد من الجينات والعناصر. يمكن المعجل عملية الحصول على استنساخ حذف biallelic عن طريق تقدير الحد الأدنى لعدد من الحيوانات المستنسخة اللازمة ليتم عرضه على أساس حجم الحذف للحصول على العدد المطلوب من الحيوانات المستنسخة مع حذف biallelic 12.
القدرة على الحصول على حذف monoallelic مع غياب حذف biallelic في توزيع احتمالي يمكن أن تشير إلى الفتك الخلية المرتبطة خسارة كاملة وظيفة. منخفض الاب equency أو الحذف غائبة يمكن أن يعكس عددا من السيناريوهات بما في ذلك الفقراء ترنسفكأيشن، sgRNAs غير فعالة أو غير فعالة الاشعال فحص PCR (بسبب عدم وجود مراقبة إيجابية للتحقق من صحة الاشعال PCR للكشف عن الحذف). خلايا GFP + يمكن استخدام كبديل للكفاءة ترنسفكأيشن (راجع الخطوة 5.2)، لذلك من المرجح يعكس انخفاضا في GFP + الخلايا الفقراء ترنسفكأيشن وانخفض والناتجة كفاءة الحذف. باستخدام اثنين من أزواج sgRNA مختلفة مع الاشعال فحص مستقلة يمكن أن تساعد في السيطرة على sgRNA غير فعال وفحص PCR الاشعال وتعظيم فرص الحصول على استنساخ حذف biallelic. خلية الفرز لGFP + الخلايا يثري للالأليلات الحذف. بينما هذه الخطوة قد يتم حذف أو إغفال من المرجح أن تستلزم فحص أكثر الحيوانات المستنسخة لتحديد تلك مع الحذف monoallelic أو biallelic. إلى درجة أن كفاءة ترنسفكأيشن قد يكون الأمثل، فإننا نتوقع كفاءة تحرير الجينوم ليتم تعزيزه.
<p cمعشوقة = "jove_content"> الأحداث NHEJ التي تكمن وراء الحذف ونتيجة إصلاح المحلية في سلسلة من الأليلات مع مجموعة متنوعة من indels في المواقع المستهدفة. نتائج السائدة هي ~ 1 صغيرة – 10 بي بي الإدراج أو الحذف أكثر شيوعا في موقع انشقاق sgRNA الموجهة (الشكل 2B). وغالبا ما تظهر هذه الأليلات أن تكون نتيجة القائم على microhomology إصلاح 34،35. وتجدر الإشارة إلى أن الاستراتيجية القائمة على الكشف PCR-وصفنا لن يحدد الإدراج أكبر أو أكثر تعقيدا، والحذف، العكس، أو إعادة ترتيب. على الرغم من أن هذه الأحداث هي أقل شيوعا، لاحظنا الحيوانات المستنسخة التي يمكن من خلالها الكشف عن لا حذف ولا amplicons غير الحذف، وعند إجراء مزيد من التحقيق تعكس هذه النتائج أكثر تعقيدا.وقد لاحظنا كريسبر واسعة / Cas9 بوساطة "تندب" من الأليلات غير الحذف من monoallelic وعدم الحذف استنساخ (انظر الشكل 2B). هذه "ندوب" تتكون منindels صغيرة تنتج في موقع sgRNA الانقسام دون حذف المقصود (أي حذف الجزء التدخل بين sgRNAs ألف وباء). هذه الندوب في كثير من الأحيان يقطع الاعتراف المستهدفة من قبل sgRNA. ولذا فإننا نحث الحذر في إعادة توجيه الأليلات في الخلايا التي سبق تعرضها للsgRNAs باستخدام نفس sgRNAs. استراتيجية إعادة توجيه أكثر نجاحا من شأنه الاستفادة sgRNA فريدة من نوعها تتابعات متميزة من قبل "ندوب" المواقع الاعتراف. في الحالات عندما يتعرف على زوج من sgRNAs تسلسل exonic (الشكل 1B، أسفل)، التي يمكن أن تنتج الأليلات انزياح الإطار حتى في حالة عدم وجود الحذف. ولذلك، استنساخ حذف monoallelic يمكن المخصب لالخسارة من وظيفة بسبب وتيرة عالية من الطفرات انزياح الإطار على غير حذف-أليل 12.
واحد قلق مع كريسبر / نظام Cas9 هو خارج الهدف آثار، أي تعديل الجيني في مواقع غير مقصودة 36-38. Rوأشارت تقارير ecent أن الرنا دليل أقصر مع 17-19 النيوكليوتيدات يمكن أن تقلل من تكرار كريسبر / خارج الهدف آثار 39 Cas9 المستندة. بالإضافة إلى ذلك، استراتيجية مزدوجة تخصر باستخدام اثنين من أدلة في الموقع المستهدف مع nickase يمكن استخدامها لإنشاء DSBs مع التقليل من خارج الهدف آثار 7. بدلا من ذلك، مماثلة لالاستراتيجيات المستخدمة لرني، نقترح أن أزواج مختلفة من sgRNAs مع غير متداخلة متواليات protospacer أن تستخدم لإظهار أن النمط الظاهري لوحظ هو نتيجة للكريسبر / Cas9 تعديل على هدف مقابل لإمكانات بعيدا عن الهدف تأثير. ومن شأن اتباع نهج مناسب يكون لتصميم اثنين على الأقل المجاورة ولكن غير متداخلة أزواج sgRNA بحيث مجموعة واحدة من الاشعال الفرز (راجع الخطوة 2) يمكن أن تستخدم للأزواج sgRNA متعددة (الشكل 1A). وعلاوة على ذلك، واستكمال خط الخلية حذف من إعادة تقديم تسلسل في عداد المفقودين و / أو الجينات تعطلت يمكن إثبات وجود علاقة سببية بينحذف الجينومية معين، والنمط الظاهري.
لعلماء الأحياء العمل مع أنظمة نموذج الخلوي، ورني يمثل أداة قوية لعلم الجينوم وظيفية. ومع ذلك، وشملت القيود المفروضة على هذا النهج غير مكتمل تخفيض في مستويات النص مرنا الهدف، عدم تجانس تأثير الكواشف مستقلة تستهدف نفس الجين، والمعروف خارج الهدف آثار بما في ذلك الآثار القائمة على البذور وغير المصنفة 40-42. استراتيجيات تحرير الجينوم وعد لمعالجة العديد من هذه الشواغل وتمثل توجها مثيرا، مكملة لاضطراب وراثي المحتملين 8،36،37. وعلاوة على ذلك، والتحرير الجينوم يسمح لدراسة غير الترميز العناصر الجينية بطريقة غير ممكن بواسطة رني والتي تمثل تحديا استهداف التقليدية نهج 25. ونحن نشجع الجيل الحذف الجينومية من قبل كريسبر / Cas9 كوسيلة من وسائل قوية ومحددة لإنتاج وتوصيف الخسارة من وظيفة الأليلات.
The authors have nothing to disclose.
Thanks to Jason Wright for suggesting the Golden Gate Assembly cloning strategy and Katherine Helming and members of Orkin lab, particularly Jian Xu, Guoji Guo, Elenoe Smith, and Partha Das for helpful discussions. This work was supported by NIH R01HL032259 and P30DK049216 (Center of Excellence in Molecular Hematology) to S.H.O. and NIDDK K08DK093705 to D.E.B.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
T4 Polynucleotide Kinase | New England Biolabs | M0201S | |
T4 DNA Ligase (with associated ligation buffer) | New England Biolabs | M0202T | |
Adenosine 5'-Triphosphate (ATP) | New England Biolabs | P0756S | |
BSA, Molecular Biology Grade | New England Biolabs | B9000S | |
BbsI Restriction Enzyme (with associated NEB Buffer 2.1) | New England Biolabs | R0539S | |
pSpCas9(BB) (pX330) | Addgene | 42230 | |
S.O.C. Medium | Life Technologies | 15544-034 | |
BTX ECM 830 | Harvard Apparatus | 45-0052 | |
BTX Solution and 2mm Cuvettes | Harvard Apparatus | 45-0803 | |
pmaxGFP Plasmid | Lonza | VPA-1003 | |
QuickExtract DNA Extraction Solution | Epicentre | QE09050 | |
HotStarTaq PCR Master Mix Kit | Qiagen | 203443 | |
Zero Blunt PCR Cloning Kit | Life Technologies | K2700-20 |