CRISPR/Cas9 is a robust system to produce disruption of genes and genetic elements. Here we describe a protocol for the efficient creation of genomic deletions in mammalian cell lines using CRISPR/Cas9.
The prokaryotic clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) 9 system may be re-purposed for site-specific eukaryotic genome engineering. CRISPR/Cas9 is an inexpensive, facile, and efficient genome editing tool that allows genetic perturbation of genes and genetic elements. Here we present a simple methodology for CRISPR design, cloning, and delivery for the production of genomic deletions. In addition, we describe techniques for deletion, identification, and characterization. This strategy relies on cellular delivery of a pair of chimeric single guide RNAs (sgRNAs) to create two double strand breaks (DSBs) at a locus in order to delete the intervening DNA segment by non-homologous end joining (NHEJ) repair. Deletions have potential advantages as compared to single-site small indels given the efficiency of biallelic modification, ease of rapid identification by PCR, predictability of loss-of-function, and utility for the study of non-coding elements. This approach can be used for efficient loss-of-function studies of genes and genetic elements in mammalian cell lines.
Recent advances in genome engineering technology have allowed for unprecedented opportunities for site-specific modification of the genome. This technology may be utilized to investigate the function of genes and regulatory elements via prospective genetic perturbation. Zinc finger nucleases (ZFNs), transcription-activator like (TAL) effector nucleases (TALENs), and CRISPR/Cas9 RNA-guided nucleases each leverage customizable DNA specificity to localize a nuclease for the introduction of DSBs1–3. The resulting DSBs can be repaired by indel-forming NHEJ or by homology-directed repair (HDR) using a donor template4.
The CRISPR/Cas9 nuclease pathway, an adaptive immune system in prokaryotic cells5, has been recently adapted for mammalian genome engineering2,3. This tool has been demonstrated to be an inexpensive, efficient, and reliable genome engineering technique6. Briefly, a complex of Streptococcus pyogenes-derived Cas9 nuclease and a sgRNA achieve target recognition via Watson-Crick base-pairing with cognate genomic DNA sequences. sgRNAs include 20-mer sequences complementary to genomic sequences adjacent to an obligate protospacer adjacent motif (PAM) NGG. Cas9 induces a DSB at a predictable position within the target site. Additionally, variants of Cas9 with single-strand cleavage capacity or catalytic inactivity may be used to facilitate “nicking” or transcriptional regulation respectively7–9. CRISPR/Cas9 has been used for a wide range of applications including both knock-in and knockout10,11, large-scale genomic deletions12–14, pooled library screening for gene discovery15,16, genetic engineering of numerous model organisms10,11,17–21, as well as gene therapy22,23.
Here we describe a protocol for efficient deletion of desired genomic regions. The protocol includes CRISPR design, cloning, and delivery, as well as deletion, identification, and characterization. Genomic deletions can be generated by the introduction of two CRISPR sgRNAs with Cas9 to induce repair of the resultant two DSBs by NHEJ with deletion of the intervening segment. This strategy has been used to create deletions ranging from one kilobase to over one megabase12. Deletions can be informative for the study of genes and other genetic elements, either in isolation or in combination. There are several potential advantages of genomic deletions as compared to HDR or single-site small indel production. First, this method capitalizes on the high efficiency of NHEJ in many cellular contexts7. The high frequency of deletion limits the number of clones needed to be screened to identify informative clones. Deletion frequency is inversely related to deletion size. Biallelic deletion clones may be retrieved at frequencies at least as great as of probabilistic expectation12. Second, both monoallelic and biallelic deletions may be easily identified and distinguished by conventional PCR, simplifying the screening process. Strategies relying on small indels or point mutations may require RFLP, allele-specific PCR, T7EN1 cleavage assay, Sanger sequencing, RT-qPCR, or immunoblotting, which may be more laborious. Third, by removing a substantial portion of a gene or element of interest, a reliable loss-of-function allele may be obtained. In contrast, frameshift mutations in protein-coding sequences may not always induce nonsense-mediated decay, may produce a hypomorphic or neomorphic allele, or target an exon excluded from an alternate isoform24. Finally, deletions may be particularly revealing for the study of non-coding DNA such as regulatory elements since frameshift mutations as produced by single-site indels would not be relevant25.
The CRISPR / Cas9 Systemet kan anvendes til at generere genomiske deletioner af en række størrelser. Selv om vi har observeret, at hyppigheden af sletningen varierer omvendt med hensyn til hensigten sletning størrelse, har vi været i stand til at inddrive sletninger på op til 1 Mb, og sletninger op til 100 kb rutinemæssigt giver flere biallele slettet kloner. Vi har observeret noget tab i effektivitet sekventielt indfører deletioner i en cellelinie. Denne strategi kan anvendes til skabelse af kombinatorisk sletning af mange gener og elementer. Processen med at opnå biallele deletionskloner kan fremskyndes ved at estimere det minimale antal af kloner, der er nødvendige for at blive screenet baseret på sletning størrelse for at opnå det ønskede antal kloner med biallel deletion 12.
Evnen til at opnå monoallelisk deletion med fraværet af biallele deletion ved probabilistisk fordeling kunne tyde celle letalitet forbundet med komplet tab af funktion. Lav frequency eller fraværende sletninger kunne afspejle en række scenarier, herunder dårlig transfektion, ineffektive sgRNAs eller ineffektive PCR screening primere (på grund af manglen på en positiv kontrol at validere PCR-primere til at screene for sletning). GFP + celler kan anvendes som et surrogat for transfektionseffektivitet (se trin 5.2), så en reduktion i GFP + -celler sandsynligvis afspejler dårlig transfektion og en deraf faldt deletion effektivitet. Brug to forskellige sgRNA par med uafhængige screening primere kan hjælpe med at kontrollere for ineffektiv sgRNA og screening PCR-primere og maksimere chancerne for at opnå biallele sletning kloner. Cellesortering for GFP + -celler beriger for sletning alleler. Mens dette trin kan udelades, vil udeladt nødvendiggør screening flere kloner for at identificere dem med monoallelisk eller biallele sletninger. I den grad, at transfektionseffektiviteten kan optimeres, ville vi forvente genom redigering effektivitet skal forbedres.
<p ctøs = "jove_content"> NHEJ begivenheder, der ligger til grund for deletioner og lokal reparation resultat i en serie af alleler med en række indels på målstederne. Den fremherskende resultat er små ~ 1 – 10 bp insertioner eller mere almindeligt deletioner på det sted sgRNA-dirigeret spaltning (figur 2B). Ofte er disse alleler synes at være resultatet af microhomology baseret reparation 34,35. Det skal bemærkes, at det PCR-baseret detektion strategi beskriver vi ikke vil identificere større eller mere komplicerede insertioner, deletioner, inversioner eller omlejringer. Selv om disse begivenheder er mindre almindelige, har vi observeret kloner, hvor hverken sletning eller ikke-sletning amplikoner kan opdages, og efter yderligere undersøgelse afspejle disse mere komplekse resultater.Vi har observeret omfattende CRISPR / Cas9-medieret "ardannelse" ikke-deletion alleler fra monoallelisk og ikke-deletionskloner (se figur 2B). Disse "ar" består afsmå indels produceret på sgRNA spaltningsstedet uden den tilsigtede sletning (dvs. udeladelse af den mellemliggende segment mellem sgRNAs A og B). Disse ar ofte afbryde mål anerkendelse fra sgRNA. Derfor vil vi opfordre til forsigtighed i retargeting alleler i celler tidligere har været udsat for sgRNAs med de samme sgRNAs. En mere succesfuld retargeting strategi ville udnytte unikke sgRNA sekvenser adskiller sig fra tidligere "arrede" Anerkendelse sites. I tilfælde, hvor et par af sgRNAs genkender exon sekvenser (figur 1B, nederst), kan frameshift alleler fremstilles selv i fravær af sletningen. Derfor kan monoallelisk deletionskloner beriges for tab af funktion på grund af den høje frekvens af rammeskift mutationer på den ikke-slettet allel 12.
En bekymring med CRISPR / Cas9 systemet er off-target effekter, dvs. genomisk modifikation på utilsigtede steder 36-38. RSENESTE rapporter har antydet, at kortere guide RNA'er med 17-19 nukleotider kan reducere hyppigheden af CRISPR / Cas9-baseret off-target effekter 39. Derudover kan en dobbelt-nicking strategi ved hjælp af to føringer pr målsted med nickase bruges til at skabe DSB'er samtidig minimere off-target virkninger 7. Alternativt analogt med strategier, der anvendes til RNAi, foreslår vi, at forskellige par sgRNAs med ikke-overlappende protospacer sekvenser bruges til at påvise, at den observerede fænotype er resultatet af CRISPR / Cas9 modifikation on target i modsætning til en potentiel off-target virkning. En bekvem fremgangsmåde ville være at designe mindst to tilstødende, men ikke-overlappende sgRNA parvis, så et enkelt sæt screening primere (se trin 2) kan bruges til flere sgRNA par (figur 1A). Desuden kan supplere en sletning cellelinie ved at genindføre de manglende sekvens og / eller forstyrres gen underbygge en årsagssammenhæng mellemen given genomisk deletion og fænotype.
For biologer, der arbejder med cellulære modelsystemer har RNAi repræsenteret et kraftfuldt værktøj til funktionel genomforskning. Imidlertid har begrænsninger ved denne metode medtaget ufuldstændig reduktion i target mRNA transkriptniveauer, heterogenitet effekt af uafhængige reagenser rettet mod samme gen, og kendte ikke-tilsigtede virkninger, herunder frø-baserede og ikke-seed virkninger 40-42. Genom redigering strategier lover at behandle mange af disse bekymringer, og repræsenterer en spændende, komplementær tilgang til potentielle genetiske forstyrrelse 8,36,37. Endvidere genom redigering muliggør studiet af ikke-kodende genetiske elementer på en måde, ikke mulig ved RNAi og udfordrende ved konventionel målretningsmetoder 25. Vi opfordrer generation af genomiske udeladelser CRISPR / Cas9 som en robust og specifik metode til at producere og karakterisere tab af funktion alleler.
The authors have nothing to disclose.
Thanks to Jason Wright for suggesting the Golden Gate Assembly cloning strategy and Katherine Helming and members of Orkin lab, particularly Jian Xu, Guoji Guo, Elenoe Smith, and Partha Das for helpful discussions. This work was supported by NIH R01HL032259 and P30DK049216 (Center of Excellence in Molecular Hematology) to S.H.O. and NIDDK K08DK093705 to D.E.B.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
T4 Polynucleotide Kinase | New England Biolabs | M0201S | |
T4 DNA Ligase (with associated ligation buffer) | New England Biolabs | M0202T | |
Adenosine 5'-Triphosphate (ATP) | New England Biolabs | P0756S | |
BSA, Molecular Biology Grade | New England Biolabs | B9000S | |
BbsI Restriction Enzyme (with associated NEB Buffer 2.1) | New England Biolabs | R0539S | |
pSpCas9(BB) (pX330) | Addgene | 42230 | |
S.O.C. Medium | Life Technologies | 15544-034 | |
BTX ECM 830 | Harvard Apparatus | 45-0052 | |
BTX Solution and 2mm Cuvettes | Harvard Apparatus | 45-0803 | |
pmaxGFP Plasmid | Lonza | VPA-1003 | |
QuickExtract DNA Extraction Solution | Epicentre | QE09050 | |
HotStarTaq PCR Master Mix Kit | Qiagen | 203443 | |
Zero Blunt PCR Cloning Kit | Life Technologies | K2700-20 |