CRISPR / Cas9 के माध्यम से स्तनधारी सेल लाइनों में जीनोमिक विलोपन का सृजन
Summary
CRISPR/Cas9 is a robust system to produce disruption of genes and genetic elements. Here we describe a protocol for the efficient creation of genomic deletions in mammalian cell lines using CRISPR/Cas9.
Abstract
The prokaryotic clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) 9 system may be re-purposed for site-specific eukaryotic genome engineering. CRISPR/Cas9 is an inexpensive, facile, and efficient genome editing tool that allows genetic perturbation of genes and genetic elements. Here we present a simple methodology for CRISPR design, cloning, and delivery for the production of genomic deletions. In addition, we describe techniques for deletion, identification, and characterization. This strategy relies on cellular delivery of a pair of chimeric single guide RNAs (sgRNAs) to create two double strand breaks (DSBs) at a locus in order to delete the intervening DNA segment by non-homologous end joining (NHEJ) repair. Deletions have potential advantages as compared to single-site small indels given the efficiency of biallelic modification, ease of rapid identification by PCR, predictability of loss-of-function, and utility for the study of non-coding elements. This approach can be used for efficient loss-of-function studies of genes and genetic elements in mammalian cell lines.
Introduction
Recent advances in genome engineering technology have allowed for unprecedented opportunities for site-specific modification of the genome. This technology may be utilized to investigate the function of genes and regulatory elements via prospective genetic perturbation. Zinc finger nucleases (ZFNs), transcription-activator like (TAL) effector nucleases (TALENs), and CRISPR/Cas9 RNA-guided nucleases each leverage customizable DNA specificity to localize a nuclease for the introduction of DSBs1–3. The resulting DSBs can be repaired by indel-forming NHEJ or by homology-directed repair (HDR) using a donor template4.
The CRISPR/Cas9 nuclease pathway, an adaptive immune system in prokaryotic cells5, has been recently adapted for mammalian genome engineering2,3. This tool has been demonstrated to be an inexpensive, efficient, and reliable genome engineering technique6. Briefly, a complex of Streptococcus pyogenes-derived Cas9 nuclease and a sgRNA achieve target recognition via Watson-Crick base-pairing with cognate genomic DNA sequences. sgRNAs include 20-mer sequences complementary to genomic sequences adjacent to an obligate protospacer adjacent motif (PAM) NGG. Cas9 induces a DSB at a predictable position within the target site. Additionally, variants of Cas9 with single-strand cleavage capacity or catalytic inactivity may be used to facilitate “nicking” or transcriptional regulation respectively7–9. CRISPR/Cas9 has been used for a wide range of applications including both knock-in and knockout10,11, large-scale genomic deletions12–14, pooled library screening for gene discovery15,16, genetic engineering of numerous model organisms10,11,17–21, as well as gene therapy22,23.
Here we describe a protocol for efficient deletion of desired genomic regions. The protocol includes CRISPR design, cloning, and delivery, as well as deletion, identification, and characterization. Genomic deletions can be generated by the introduction of two CRISPR sgRNAs with Cas9 to induce repair of the resultant two DSBs by NHEJ with deletion of the intervening segment. This strategy has been used to create deletions ranging from one kilobase to over one megabase12. Deletions can be informative for the study of genes and other genetic elements, either in isolation or in combination. There are several potential advantages of genomic deletions as compared to HDR or single-site small indel production. First, this method capitalizes on the high efficiency of NHEJ in many cellular contexts7. The high frequency of deletion limits the number of clones needed to be screened to identify informative clones. Deletion frequency is inversely related to deletion size. Biallelic deletion clones may be retrieved at frequencies at least as great as of probabilistic expectation12. Second, both monoallelic and biallelic deletions may be easily identified and distinguished by conventional PCR, simplifying the screening process. Strategies relying on small indels or point mutations may require RFLP, allele-specific PCR, T7EN1 cleavage assay, Sanger sequencing, RT-qPCR, or immunoblotting, which may be more laborious. Third, by removing a substantial portion of a gene or element of interest, a reliable loss-of-function allele may be obtained. In contrast, frameshift mutations in protein-coding sequences may not always induce nonsense-mediated decay, may produce a hypomorphic or neomorphic allele, or target an exon excluded from an alternate isoform24. Finally, deletions may be particularly revealing for the study of non-coding DNA such as regulatory elements since frameshift mutations as produced by single-site indels would not be relevant25.
Protocol
Representative Results
Discussion
CRISPR / Cas9 प्रणाली आकारों की एक श्रेणी के जीनोमिक विलोपन उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। हम हटाए जाने की आवृत्ति इरादा विलोपन आकार के संबंध में विपरीत रूप से भिन्न होता है देखा है कि हालांकि, हम नियमित रूप से कई biallelic नष्ट कर दिया क्लोन उपज 100 KB अप करने के लिए अप करने के लिए 1 एमबी का विलोपन, और विलोपन ठीक करने में सक्षम किया गया है। हम एक सेल लाइन में क्रमिक रूप से शुरू करने विलोपन की दक्षता में कोई नुकसान नहीं मनाया है। इस रणनीति के कई जीन और तत्वों की मिश्रित विलोपन के निर्माण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। biallelic विलोपन क्लोन प्राप्त करने की प्रक्रिया biallelic विलोपन 12 के साथ क्लोन की वांछित संख्या प्राप्त करने के लिए हटाए जाने के आकार के आधार पर जांच किए जाने की आवश्यकता क्लोन की न्यूनतम संख्या का आकलन करके तेजी लाई जा सकती है।
संभाव्य वितरण में biallelic विलोपन के अभाव के साथ monoallelic विलोपन प्राप्त करने की क्षमता समारोह का पूरा नुकसान के साथ जुड़े सेल मारक का संकेत मिलता है। कम frequency या अनुपस्थित विलोपन गरीब अभिकर्मक, अक्षम sgRNAs या कारण (एक सकारात्मक नियंत्रण की कमी के कारण हटाए जाने के लिए स्क्रीन के लिए पीसीआर प्राइमरों मान्य करने के लिए) अकुशल पीसीआर स्क्रीनिंग प्राइमरों सहित परिदृश्यों की एक संख्या को प्रतिबिंबित कर सके। GFP + कोशिकाओं, अभिकर्मक दक्षता (कदम 5.2 देखें) के लिए एक किराए के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है ताकि GFP + कोशिकाओं में कमी होने की संभावना गरीब अभिकर्मक को दर्शाता है और जिसके परिणामस्वरूप एक विलोपन दक्षता की कमी हुई। अक्षम sgRNA के लिए नियंत्रण में मदद कर सकते हैं स्वतंत्र स्क्रीनिंग प्राइमरों के साथ दो अलग अलग sgRNA जोड़े का प्रयोग और पीसीआर प्राइमरों स्क्रीनिंग और biallelic विलोपन क्लोन प्राप्त करने की संभावना को अधिकतम। GFP + कोशिकाओं के लिए सेल छँटाई विलोपन alleles के लिए समृद्ध करती है। इस कदम से हटाया जा सकता है, चूक की संभावना monoallelic या biallelic विलोपन के साथ उन लोगों की पहचान करने के लिए और अधिक क्लोन स्क्रीनिंग की जरूरत होगी। अभिकर्मक दक्षता अनुकूलित किया जा सकता है कि डिग्री करने के लिए, हम जीनोम संपादन दक्षता बढ़ाने की उम्मीद है।
<p cलड़की = "jove_content" लक्ष्य स्थलों पर indels की एक किस्म के साथ alleles श्रृंखला में विलोपन और स्थानीय मरम्मत परिणाम आबाद है कि> NHEJ घटनाओं। 10 बीपी सम्मिलन या अधिक सामान्यतः sgRNA निर्देशित दरार (चित्रा 2B) की साइट पर विलोपन – प्रमुख परिणाम छोटे ~ 1 है। अक्सर इन alleles के microhomology आधारित मरम्मत 34,35 का नतीजा हो दिखाई देते हैं। यह हम वर्णन पीसीआर आधारित पता लगाने की रणनीति बड़ा या अधिक जटिल सम्मिलन, विलोपन, व्युत्क्रमों, या rearrangements की पहचान नहीं होगा कि ध्यान दिया जाना चाहिए। इन घटनाओं में कम आम हैं, यद्यपि हम न तो विलोपन और न ही गैर-विलोपन amplicons पता लगाया जा सकता है जिसमें क्लोन मनाया, और आगे की जांच पर इन अधिक जटिल परिणामों को प्रतिबिंबित किया है।हम व्यापक CRISPR / monoallelic और गैर-विलोपन क्लोन से गैर-विलोपन alleles की "scarring के" Cas9 की मध्यस्थता मनाया है (चित्रा 2B देखें)। ये "निशान" से मिलकर बनता हैइच्छित विलोपन के बिना sgRNA दरार स्थल पर उत्पादन छोटे indels (यानी, sgRNAs ए और बी के बीच बीच के खंड का विलोपन)। ये निशान अक्सर sgRNA द्वारा लक्ष्य मान्यता में व्यवधान डाला। इसलिए हम पहले से ही sgRNAs का उपयोग कर sgRNAs के संपर्क में कोशिकाओं में alleles के retargeting में सावधानी से आग्रह करता हूं। अद्वितीय sgRNA का उपयोग होगा एक और अधिक सफल पुनर्लक्ष्यीकरण रणनीति पहले "जख्म" मान्यता साइटों से अलग दृश्यों। मामलों में sgRNAs की एक जोड़ी (चित्रा 1 बी, नीचे), frameshift एलील भी विलोपन के अभाव में उत्पादन किया जा सकता है exonic दृश्यों को पहचानता है। इसलिए, monoallelic विलोपन क्लोन कारण एलील 12 गैर नष्ट कर दिया पर frameshift म्यूटेशन के उच्च आवृत्ति को नुकसान के समारोह के लिए समृद्ध किया जा सकता है।
38 – CRISPR / Cas9 प्रणाली के साथ एक चिंता का विषय बंद लक्ष्य प्रभाव, यानी, अनायास ही साइटों 36 पर जीनोमिक संशोधन है। आरecent रिपोर्टों 17 के साथ छोटे गाइड RNAs सुझाव दिया है कि – 19 न्यूक्लियोटाइड CRISPR की आवृत्ति को कम कर सकते हैं / बंद लक्ष्य प्रभाव 39 Cas9 आधारित। इसके अतिरिक्त, एक nickase साथ लक्ष्य साइट प्रति दो गाइडों का उपयोग करते हुए एक डबल Nicking रणनीति बंद लक्ष्य प्रभाव सात जबकि कम से कम DSBs बनाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, आरएनएआई के लिए इस्तेमाल किया रणनीति के अनुरूप है, हम गैर अतिव्यापी protospacer दृश्यों के साथ sgRNAs के विभिन्न जोड़े बंद लक्ष्य एक संभावित विरोध के रूप में मनाया फेनोटाइप पर लक्ष्य CRISPR / Cas9 संशोधन का परिणाम है कि प्रदर्शन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सुझाव है कि प्रभाव। एक सुविधाजनक दृष्टिकोण स्क्रीनिंग प्राइमरों (चरण 2 देखें) का एक सेट एकाधिक sgRNA जोड़े (चित्रा 1 ए) के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, ताकि कम से कम दो आसन्न लेकिन गैर अतिव्यापी sgRNA जोड़े डिजाइन करने के लिए किया जाएगा। इसके अलावा, लापता अनुक्रम और / या बाधित जीन reintroducing द्वारा एक विलोपन सेल लाइन के पूरक के बीच एक कारण रिश्ते को पुष्ट कर सकते हैंएक दिया जीनोमिक विलोपन और फेनोटाइप।
सेलुलर मॉडल सिस्टम के साथ काम कर रहे जीव के लिए, आरएनएआई कार्यात्मक जीनोमिक्स के लिए एक शक्तिशाली उपकरण का प्रतिनिधित्व किया है। 42 – हालांकि, इस दृष्टिकोण की सीमाओं लक्ष्य mRNA प्रतिलेख के स्तर में अधूरा कमी, एक ही जीन को लक्षित स्वतंत्र अभिकर्मकों के प्रभाव की विविधता, और बीज आधारित और गैर-बीज प्रभाव 40 सहित ज्ञात बंद लक्ष्य प्रभाव को शामिल किया है। जीनोम संपादन रणनीतियों इन चिंताओं में से कई को संबोधित करने का वादा और भावी आनुवंशिक गड़बड़ी 8,36,37 के लिए एक रोमांचक, पूरक दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करते हैं। इसके अलावा, जीनोम संपादन आरएनएआई के द्वारा ही संभव है और पारंपरिक लक्ष्य-निर्धारण से चुनौतीपूर्ण नहीं एक तरह से आनुवंशिक तत्वों गैर-कोडिंग 25 दृष्टिकोण के अध्ययन के लिए अनुमति देता है। हम उत्पादन और नुकसान के समारोह एलील चिह्नित करने के लिए एक मजबूत और विशिष्ट पद्धति के रूप में CRISPR / Cas9 द्वारा जीनोमिक विलोपन की पीढ़ी के लिए प्रोत्साहित करते हैं।
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Thanks to Jason Wright for suggesting the Golden Gate Assembly cloning strategy and Katherine Helming and members of Orkin lab, particularly Jian Xu, Guoji Guo, Elenoe Smith, and Partha Das for helpful discussions. This work was supported by NIH R01HL032259 and P30DK049216 (Center of Excellence in Molecular Hematology) to S.H.O. and NIDDK K08DK093705 to D.E.B.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| T4 Polynucleotide Kinase | New England Biolabs | M0201S | |
| T4 DNA Ligase (with associated ligation buffer) | New England Biolabs | M0202T | |
| Adenosine 5'-Triphosphate (ATP) | New England Biolabs | P0756S | |
| BSA, Molecular Biology Grade | New England Biolabs | B9000S | |
| BbsI Restriction Enzyme (with associated NEB Buffer 2.1) | New England Biolabs | R0539S | |
| pSpCas9(BB) (pX330) | Addgene | 42230 | |
| S.O.C. Medium | Life Technologies | 15544-034 | |
| BTX ECM 830 | Harvard Apparatus | 45-0052 | |
| BTX Solution and 2mm Cuvettes | Harvard Apparatus | 45-0803 | |
| pmaxGFP Plasmid | Lonza | VPA-1003 | |
| QuickExtract DNA Extraction Solution | Epicentre | QE09050 | |
| HotStarTaq PCR Master Mix Kit | Qiagen | 203443 | |
| Zero Blunt PCR Cloning Kit | Life Technologies | K2700-20 |
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