वेस्ट नील वायरस उत्परिवर्ती तनाव संक्रमण को Myd88 की मध्यस्थता सेलुलर प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के इन विट्रो विश्लेषण में
Summary
Two flow cytometry-based methods – an in vitro T cell priming assay and intracellular cytokine staining were utilized to measure antigen presenting capacity of dendritic cells and antigen-specific T cell responses to a West Nile virus mutant infection in mice.
Abstract
चूहों में जंगली प्रकार WNV की तुलना में अधिक सहज साइटोकाइन और टी सेल प्रतिक्रिया प्रेरित एक तनु वेस्ट नील वायरस (WNV), एक nonstructural (एन एस) 4 बी-P38G उत्परिवर्ती। हाल ही में, माइलॉयड भेदभाव कारक 88 (MyD88) संकेतन WNV NS4B-P38G उत्परिवर्ती संक्रमण के दौरान प्रारंभिक टी सेल भड़काना और स्मृति टी सेल के विकास के लिए महत्वपूर्ण होने के लिए दिखाया गया था। इस अध्ययन में, दो cytometry आधारित विधियों प्रवाह – एक में इन विट्रो टी सेल भड़काना परख और एक intracellular साइटोकाइन धुंधला (आईसीएस) – वृक्ष के समान कोशिकाओं (DCs) और टी सेल कार्यों का आकलन करने के लिए उपयोग किया गया। OTII ट्रांसजेनिक चूहों की सीडी 4+ टी कोशिकाओं में लेबल – परख भड़काना टी सेल में, सेल प्रसार Carboxyfluorescein succinimidyl एस्टर (CFSE) के साथ चूहों के दोनों समूहों से DCs के सह-संस्कृति निम्न प्रवाह cytometry द्वारा विश्लेषण किया गया था। काफी परंपरा से समग्र संवेदनशीलता में सुधार के साथ इस दृष्टिकोण सीडी 4+ टी कोशिकाओं proliferating का प्रतिशत का सही निर्धारण प्रदान कीअल रेडियोधर्मी अभिकर्मकों के साथ assays। एक microcentrifuge ट्यूब प्रणाली आईसीएस प्रोटोकॉल के दोनों सेल संस्कृति और साइटोकाइन धुंधला प्रक्रियाओं में इस्तेमाल किया गया था। पारंपरिक टिशू कल्चर प्लेट आधारित प्रणाली की तुलना में, इस संशोधित प्रक्रिया जैव सुरक्षा स्तर (बीएल) 3 सुविधाओं में प्रदर्शन करने के लिए आसान था। इसके अलावा, WNV- संक्रमित कोशिकाओं BL3 सुविधाएं बाहर आगे के विश्लेषण सक्षम है, जो दोनों assays के, में paraformaldehyde के साथ इलाज किया गया। कुल मिलाकर, इन में इन विट्रो प्रतिरक्षाविज्ञानी assays के कुशलतापूर्वक WNV संक्रमण के दौरान सेल की मध्यस्थता प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
Introduction
वेस्ट नील वायरस (WNV), एक neurotropic, प्लस-लगा flavivirus, एक उभरती हुई सार्वजनिक स्वास्थ्य खतरा है। वर्तमान में, कोई टीके मानव उपयोग के 1 के लिए अनुमोदित किया गया है। Nonstructural (एन एस) 4 बी प्रोटीन में एक P38G प्रतिस्थापन है, जो एक तनु WNV तनाव, जंगली प्रकार WNV NY99 तनाव 2 से चूहों में कोई चूहों में मारक लेकिन उच्च जन्मजात साइटोकिन्स और टी सेल प्रतिक्रिया प्रेरित करने के लिए जाना जाता है। NS4B-P38G उत्परिवर्ती साथ प्रतिरक्षित चूहों सभी घातक जंगली प्रकार WNV के साथ एक उच्च माध्यमिक चुनौती से संरक्षित किया गया। इस NS4B-P38G उत्परिवर्ती एक आदर्श टीका उम्मीदवार के लिए उपयुक्त सुविधाओं है कि पता चलता है। NS4B-P38G उत्परिवर्ती उच्च सुरक्षा अनुकूली उन्मुक्ति लाती तंत्र है जिसके द्वारा स्पष्ट रूप से अभी तक समझ नहीं रहे हैं। रोगज़नक़ जुड़े आणविक पैटर्न पहचान जो टोल की तरह रिसेप्टर्स (TLRs), वायरल संक्रमण के लिए सहज उन्मुक्ति की दीक्षा में एक आवश्यक भूमिका निभाते हैं। कोर TLR संकेतन मार्ग माइलॉयड भेदभाव प्राथमिक प्रतिक्रिया जीई का इस्तेमालप्राथमिक एडाप्टर 3,4 के रूप में पूर्वोत्तर के 88 (MyD88)। हाल के एक अध्ययन में, MyD88 संकेतन चूहों 5 में WNV NS4B- P38G उत्परिवर्ती संक्रमण के दौरान सेल की मध्यस्थता उन्मुक्ति के विकास में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के लिए दिखाया गया था। Dentritic कोशिकाओं (DCs) वायरल संक्रमण 6,7 के दौरान प्राथमिक टी सेल प्रतिक्रिया आरंभ करने के लिए अद्वितीय क्षमता का प्रदर्शन सबसे महत्वपूर्ण प्रतिजन पेश कोशिकाओं में से एक हैं। सीडी 4 + और सीडी 8 + टी कोशिकाओं को लंबे समय तक चलने वाले सुरक्षात्मक प्रतिरक्षा करने के लिए योगदान और जंगली प्रकार WNV संक्रमण 8,9 निम्नलिखित मेजबान अस्तित्व के लिए महत्वपूर्ण हैं दोनों। दो प्रतिरक्षाविज्ञानी assays के NS4B-P38G उत्परिवर्ती संक्रमित चूहों में इन कोशिकाओं के कार्यों का आकलन करने के लिए इस अध्ययन में इस्तेमाल किया गया।
/ – – चूहों सबसे पहले, एक में इन विट्रो टी सेल भड़काना परख WNV संक्रमित जंगली प्रकार और MyD88 की DCs के प्रतिजन पेश क्षमता तुलना करने के लिए उपयोग किया गया था। परख, भोले सीडी 4 <की संवेदनशीलता को बढ़ाने के लिएCFSE (WNV संक्रमित चूहों के 339. DCs शुद्ध थे, और Carboxyfluorescein succinimidyl ईस्टर के साथ सह सुसंस्कृत – समर्थन> + टी कोशिकाओं 323 (ओवीए) पेप्टाइड चिकन ovalbumin के लिए एक Vα2 / Vβ5 TCR विशिष्ट व्यक्त जो OTII ट्रांसजेनिक चूहों से अलग थे ओवीए पेप्टाइड की उपस्थिति में) -labeled सीडी 4+ टी कोशिकाओं। सह संस्कृति के 5 दिनों के बाद, कोशिकाओं को काटा गया और paraformaldehyde (पीएफए) के साथ तय की और प्रवाह cytometry द्वारा विश्लेषण किया। Proliferative assays के पारंपरिक रूप से पाँच-ब्रोमो-2'- deoxyuridine (BrdU) या tritiated थाइमिन deoxyriboside (3 HTdr) 10 के समावेश के माध्यम से बाहर किया गया है। फिर भी, इन assays रेडियोधर्मी और / या WNV अध्ययनों का आयोजन कर रहे हैं, जहां जैव सुरक्षा स्तर (बीएल) 3 की सुविधा है, पर विशेष उपकरणों की जरूरत में या तो कर रहे हैं। CFSE अधिक सामान्यतः बन प्रतिरक्षाविज्ञानी assays में इस्तेमाल किया गया है महत्वपूर्ण डाई की प्रतिदीप्ति तीव्रता के धारावाहिक संयोग से लिम्फोसाइट प्रसार के प्रवाह cytometric विश्लेषण डाई अधिक है stably है के रूप मेंऔर समान रूप से, कोशिकाओं में शामिल प्रवाह cytometry द्वारा आसानी से पता लगाया है, और 11 nonradioactive है। परख भी कोशिका विभाजन की संख्या का आकलन करने की क्षमता है। WNV अध्ययन में इस परख का उपयोग करने का एक प्रमुख लाभ 1-2% पीएफए के साथ संक्रमित कोशिकाओं का निर्धारण एक BL2 प्रयोगशाला में एक प्रवाह cytometer के साथ नमूना अधिग्रहण सक्षम हो जाएगा जो WNV 12, निष्क्रिय कर सकता है।
इसके बाद, एक संशोधित intracellular साइटोकाइन धुंधला (आईसीएस) प्रक्रिया MyD88 NS4B-P38G उत्परिवर्ती संक्रमित चूहों में WNV विशेष टी सेल प्रतिक्रिया के नियमन में संकेत की भूमिका का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। इस परख में, संक्रमित चूहों से अलग splenocytes WNV विशिष्ट पेप्टाइड्स के साथ इन विट्रो में इलाज किया गया। Brefeldin एक कोशिका के भीतर साइटोकिन्स बनाए रखने के लिए जोड़ा गया है। 5 घंटा ऊष्मायन के बाद, सेल, काटा धोया और टी सेल सबसेट के लिए दाग रहे थे। कोशिकाओं तो, पीएफए में तय permeabilized और इंटरफेरॉन (IFN) -γ के लिए दाग और प्रवाह cytometry द्वारा विश्लेषण किया गया।कोशिकाओं निर्धारण और पीएफए युक्त permeabilization के बफर के साथ व्यवहार कर रहे हैं एक बार अन्य फ्लो आधारित परख के साथ के रूप में, संक्रमित नमूने आगे की प्रक्रिया और विश्लेषण के लिए एक BL2 प्रयोगशाला को हस्तांतरित किया जा सकता है। कई प्रकाशित अध्ययन में, हम WNV संक्रमित चूहों 13,14 में टी सेल प्रेरक कार्यों को मापने के लिए आईसीएस का इस्तेमाल किया है। यह अच्छी तरह से स्थापित है, हालांकि, इस परख की एक बड़ी खामी प्रक्रिया बहुत लंबी है और BL3 सुविधाओं के अंदर प्रदर्शन किया जब खपत अधिक समय हो सकता है। इधर, एक माइक्रो अपकेंद्रित्र ट्यूब आधारित आईसीएस विधि अधिक संभव आसान आगे बढ़ने के लिए और कम समय एक BL3 प्रयोगशाला के भीतर किया जब खपत होना दिखाया गया था।
Protocol
Representative Results
Discussion
WNV एक BL3 रोगजनक है। कारण सुरक्षा नियमों को, WNV संक्रमित नमूनों के साथ प्रतिरक्षाविज्ञानी assays के अक्सर BL3 सुविधाओं या प्रदर्शन करने के लिए अधिक लंबा और थकाऊ पर उपकरणों की उपलब्धता के द्वारा प्रतिबंधित कर रह?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by NIH grants to T.W. (R01AI072060 and R01AI099123). G. Xie was supported by a Sealy Center for Vaccine Development Predoctoral Fellowship. We thank Dr. Richard Flavell (Howard Hughes Medical Institute, Yale University School of Medicine, New Haven) and Dr. Shizuo Akira (Osaka University, Japan) for providing the MyD88–/– mice and Dr. Y Cong (UTMB, Galveston) for providing OTII transgenic mice.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 11875 | warm up at 37C |
| anti-CD11c magnetic beads | Miltenyi Biotec | 130-052-001 | follow the manufacturer’s instructions |
| anti-CD4 magnetic beads | Miltenyi Biotec | 130-095-248 | follow the manufacturer’s instructions |
| CFSE | Invitrogen | C34554 | |
| OVA residue 323-339 | Genscript Corporation | RP10610 | |
| Peptides | Proimmune | PC0AD-D | |
| Brefeldin A solution | BD Bioscience | 555029 | |
| Mouse Fc Blocker | e-Bioscience | 14-0161-85 | |
| APC-conjugated CD4 | e-Bioscience | 17-0041-81 | |
| FITC-conjugated CD8 | e- bioscience | 11-0081-82 | |
| Fixation/Permeabilization Solution | BD- Bioscience | 554722 | |
| Permeabilization/wash buffer | BD- Bioscience | 554723 | |
| anti-IFNg-PE | e-Bioscience | 12-7311-82 | |
| Accuri flow cytometer | BD Bioscience |
References
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