Her presenterer vi en protokoll som gjør at etterforskeren å vurdere leukocytter rekrutteringsdynamikk ex vivo ved å koble et kammer belagt med endotelceller-avledet adhesjonsmolekyler til sirkulasjonssystemet av en mus. Denne fremgangsmåte gir betydelige fordeler ettersom det gjør det mulig for leukocytt vurdering under relative biologiske betingelser.
Leukocytt-endotelial interaksjoner er tidlige og kritiske hendelser i akutt og kronisk betennelse og kan, når dysregulerte, megle vevskade som fører til varig patologisk skade. Eksisterende konvensjonelle analyser tillate analyse av leukocytt adhesjonsmolekyler bare etter ekstraksjon av leukocytter fra blodet. Dette krever blodet til å gjennomgå flere trinn før perifere blodleukocytter (PBL) kan være klar for analyse, noe som i sin tur kan stimulere PBL påvirker forskningsresultater. Den autoperfused micro flyt kammer analysen, men tillater forskere å studere tidlige leukocytter funksjonelle feilregulering ved hjelp av systemisk flyt av en levende mus samtidig ha friheten til å manipulere en belagt kammer. Gjennom en sykdomsmodell, kan den funksjonelle ekspresjon av leukocytt adhesjonsmolekyler bli vurdert og kvantifisert i en mikro-glasskammer belagt med immobiliserte endotelial adhesjonsmolekyler ex vivo. I denne modellen, strømmer blodetmellom høyre halspulsåre og venstre ytre halsvene av en levende mus under anestesi, slik at samspillet mellom innfødte PBL i kammeret. Sanntids eksperimentell analyse er oppnådd ved hjelp av en intravital mikroskop samt en Harvard Apparatus trykkanordning. Anvendelsen av en strømningsregulator ved inngangspunktet av glasskammeret lar sammenlignbare fysiologiske strømningsforhold blant eksperimentene. Leukocytt rullende hastighet er det viktigste resultatet og måles ved hjelp av National Institutes of Health open-access programvare ImageJ. Oppsummert gir autoperfused micro flyt kammer analysen en optimal fysiologisk miljø for å studere leukocytter endothelial samhandling og tillater forskerne å trekke presise konklusjoner når studere betennelse.
Betennelse er kroppens universell reaksjon på skade og er et viktig skritt i både medfødte og adaptive immunsystemet funksjon. Som svar til skade og / eller betennelses stimuli, endotelceller oppregulere spesifikke adhesjonsmolekyler; dette fører til leukocyttfrie bloduttredelse gjennom mikrovaskulær endotelet, primært i postkapillære venuler. Denne prosessen starter med deling av de frittflytende leukocytter i blodet på endotelet. Stabil rullende og fast adhesjon av leukocytter, noe som igjen fører til transmigrasjon og sekresjonen av cytotoksiske midler, følger denne forankre 1,2. Selectins er kjent for å formidle de tidlige trinnene i kaskade 3-5; inte er ansvarlig for de senere trinnene av fast heft og sjele 1,6-8.
En økende mengde bevis tyder på leukocytter og endotelceller adhesjonsmolekyler har viktige roller i dyremodeller av iskemi reperfusjonsskade, Astma, psoriasis, multippel sklerose, og aldersrelatert makuladegenerasjon 9-12. Under disse betingelser er den inflammatoriske responsen irrelevante for å angripe en egen kropp, noe som resulterer i nedbryting av friskt vev. Eksisterende antiinflammatoriske midler (for eksempel ikke-steroide antiinflammatoriske midler, kortikosteroider eller andre cytostatika) bære risikoen for alvorlige bivirkninger med langsiktig bruk 13. Derfor er det av stor interesse å ha de nødvendige verktøy med evnen til å identifisere sykdomsspesifikke molekyler, noe som til syvende og sist kan være målrettet for å ha den ønskede anti-inflammatorisk effekt, mens gjenværende ikke-toksisk 14.
Eksisterende in vitro-metoder som det statiske leukocyttadhesjon assay ble anvendt så tidlig som i 1976 15. Det parallelle strømningskammeret ble først anvendt in vitro i 1987 for å studere leukocytt endotelial-interaksjoner i henhold til strømningsforhold. I disse eksperimentene, stimulert human resn polymorfonukleære leukocytter (PMN) fra venøst blod ble perfusert over et monolag av primære humane umbilikalvene endotelceller (HUVECs). For å kontrollere for hemodynamisk strømningsforhold, ble Harvard Apparatus sprøytepumpen ansatt 16. Alternativt, for å unngå kunstige leukocytter isolert, ble helblod anvendes i kombinasjon med glasskammer belagt med immobiliserte adhesjonsmolekyler 17.
For å unngå leukocytt stimulering og til mechanistically studere deres interaksjon med adhesjonsmolekylene henhold omtrent fysiologiske forhold, en ex vivo autoperfused, ekstrakorporal, arteriovenøs kretsen ble utviklet 16. I denne kretsen, renner blod mellom høyre halspulsåre og venstre ytre halsvene av en levende mus under narkose, slik at samspillet mellom innfødte PBLs innenfor et glass microflow kammer belagt med singel eller co-immobilisert adhesjonsmolekyler. En stor fordel til dette system er evnen til å anvende genetisk modifiserte mus, hvori inflammatoriske veier er direkte eller indirekte manipulert. I tillegg er det muligheten til å lokalisere den isolerte bidraget av leukocytt adhesjonsmolekyler til betennelse, uten ekstern aktivering under strømningsforhold. Anvendelsen av en strømningsregulator ved inngangspunktet til strømningskammeret gir et bredt spekter av eksperimentelle variasjoner av skjærkrefter for å etterligne enten arteriell eller venøs systemer 18-22. Her beskriver vi i stor detalj en protokoll om forberedelse og gjennomføring av ex vivo autoperfused microflow kammer analysen.
Prosessen med leukocytt rekruttering er et viktig skritt i den inflammatoriske respons; det innebærer migrasjon av leukocytter fra sirkulasjonssystemet mot målvev, der de er i stand til å utøve sin effektorfunksjon. Leukocytt-rekruttering er integrert i en rekke inflammatoriske tilstander så som aterosklerotisk plakk, myokardinfarkt, ischemi / reperfusjon, og transplantasjonskirurgi 1, så vel som flere CNS-relaterte nevroinflammatoriske tilstander 10-12,20,24,25. Vurderer mangfoldet av sykdomstilstander som leukocytter rekrutterings spenn, gir den autoperfused microflow kammeret et uunnværlig verktøy slik at etterforsker muligheten til å studere Leukocyttmigrering dynamikk.
I løpet av de siste tiårene, har en rekke in vitro blitt utviklet for å studere dynamikken i leukocytt celle adhesjon 26. Dessverre er alle disse analysene krever utvinning avleukocytter fra blodet, innføre mekanisk aktivering. Å komme nærmere in vivo miljøet, ble tilpasninger gjort for å samle hele blodprøver og kontrollere hemodynamisk strømningsforhold 16,17. Her strekker vi de foregående fremskritt i feltet ved å knytte en belagt kammeret til mus sirkulasjonssystemet. Vi er i stand til å regulere strømmen av blod til et fysiologisk område og studere dynamikken i leukocytt rulle. Den belagt kammer gir oss muligheten til å studere leukocytter interaksjon med spesifikke adhesjonsmolekyler. Siden systemet fungerer som en enhet som drives av et levende mus, nærmere etterligner det naturlige miljøet, slik at vi kan studere leukocytt-endotelial interaksjoner i en rekke immunologiske musemodeller. I tillegg gir dette systemet oss å dra nytte av de mange genetiske musemodeller tilgjengelig. Mens systemet ikke helt replikere in vivo miljøet, det gir en plattform for å studere spesific elementer av leukocytter i henhold til fysiologiske forhold, en prestasjon som ikke tidligere har vært mulig. Selv om dette tar oss et skritt nærmere en mer fysiologisk miljø er det begrensninger i systemet. Det betyr ikke helt gjenskape den komplekse 3D-matrise av blodkar, slik at vi bare er i stand til å vurdere visse elementer av leukocytter interaksjoner som er begrenset til kammeret belegg. I tillegg bør det utvises stor forsiktighet for å sikre et lukket system til musen sirkulasjon ved å følge alle trinnene som er nevnt i protokollen. Innføring av luftbobler vil i stor grad påvirke nøyaktigheten og reproduserbarheten av forsøkene.
Mens vi beskriver bruken av Autoperfused Microflow kammer for vurdering av leukocytt-rulle dynamikk prosedyren har potensiale til å bli tilpasset av forskere for å studere en rekke sykdommer. For eksempel kreftceller metastaserer ved å uttrykke mange av de vanlige griner som deles av leukocytter. Studying sine rullende dynamikk i en innstilling som nærmere etterligner en in vivo miljø kan bidra i vår kunnskap, og muligens prediksjon, av invasiv natur av visse kreftceller. En mulig tilnærming kan være å kombinere en merkingsteknikk for kreftceller, slik som GFP 27, sammen med strømningskammeret assay for å spore rullende dynamikken i kreftceller som uttrykker GFP. Gitt fleksibiliteten til belegging av kammeret med en rekke stoffer, og koble flere kamre til den samme musen vil det være interessant å se hvordan denne fremgangsmåten er modifisert for bruk i andre laboratorier i kombinasjon med genetisk modifiserte mus og sykdomsmodeller. Teknikken vi beskriver her bare berører et mye bredere anvendelsespotensial som kun er begrenset av kreativiteten til etterforskeren.
The authors have nothing to disclose.
Forskning rapportert i denne publikasjonen ble støttet av National Eye Institute of National Institutes of Health i henhold til tildelings tall: R01EY022084 / S1 (KMC), T32EY007145 (HS) og P30EY014104. Innholdet er utelukkende ansvaret til forfatterne og representerer ikke nødvendigvis de offisielle visningene av National Institutes of Health. Ekstra støtte ble gitt av Massachusetts Lions Eye Research Fund (KMC) og en Special Scholar Award fra forskning for å hindre blindhet (til KMC).
Material | Vendor | Part number |
Micro glass chamber 0.4×0.04x50mm | VitroCom | 2540-050 |
Polyethylene tubing PE 10 | Fisher Scientific | 427400 |
Polyethylene tubing PE 60 | Fisher Scientific | 427416 |
Silicone tubing 002 | Fisher Scientific | 11-189-15A |
Y tube | Value Plastics | Y210-6 |
T tube | value plastics | T410-6 |
Silicone gel | Hardware store – Home Depo | |
35mm petri dish | Corning | 430165 |
Parafilm | Pechiney Plastic Packaging | PM996 |
Fine forceps | FST | 11253-25 |
Fine scissors | FST | 15000-08 |
Tube holder | FST | 00608-11 |
Clamp applicator | FST | 18057-14 |
Vascular clamp | FST | 18055-04 |
6-0 silk sutures | George Tiemann & Co | 160-1215-6/0 |
25x1G needles | BD | 305125 |
30×1/2G needles | BD | 305106 |
Heparin 100 USP units/ml | Hospital pharmacy |