Fluoreszenz-Abschrecken eines Liposomenverkapseltes NIR-Fluorophore als Instrument zur<em> In-vivo-</em> Optical Imaging

Summary

The use of fluorophores for in vivo imaging can be greatly limited by opsonization, rapid clearance, low detection sensitivity and cytotoxic effects on the host. Encapsulation of fluorophores in liposomes by film hydration and extrusion leads to fluorescence quenching and protection which enables in vivo imaging with high detection sensitivity.

Abstract

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous number of imaging techniques currently available and the progress in instrumentation, there is still a need for highly sensitive probes that are suitable for in vivo imaging. One typical problem of available preclinical fluorescent probes is their rapid clearance in vivo, which reduces their imaging sensitivity. To circumvent rapid clearance, increase number of dye molecules at the target site, and thereby reduce background autofluorescence, encapsulation of the near-infrared fluorescent dye, DY-676-COOH in liposomes and verification of its potential for in vivo imaging of inflammation was done. DY-676 is known for its ability to self-quench at high concentrations. We first determined the concentration suitable for self-quenching, and then encapsulated this quenching concentration into the aqueous interior of PEGylated liposomes. To substantiate the quenching and activation potential of the liposomes we use a harsh freezing method which leads to damage of liposomal membranes without affecting the encapsulated dye. The liposomes characterized by a high level of fluorescence quenching were termed Lip-Q. We show by experiments with different cell lines that uptake of Lip-Q is predominantly by phagocytosis which in turn enabled the characterization of its potential as a tool for in vivo imaging of inflammation in mice models. Furthermore, we use a zymosan-induced edema model in mice to substantiate the potential of Lip-Q in optical imaging of inflammation in vivo. Considering possible uptake due to inflammation-induced enhanced permeability and retention (EPR) effect, an always-on liposome formulation with low, non-quenched concentration of DY-676-COOH (termed Lip-dQ) and the free DY-676-COOH were compared with Lip-Q in animal trials.

Introduction

Liposomen wurden intensiv untersucht und als eine der biokompatiblen biomedizinischen Arzneimittelabgabesysteme für klinische Anwendungen ^1,2. Sie werden hauptsächlich aus Phospholipiden und Cholesterin, die beide biokompatible Verbindungen nachahmen Teile Natur Zellmembranen besteht. Erwägung, hydrophilen Substanzen können in dem wässrigen Innenraum eingeschlossen werden können lipophile Wirkstoffe in der Liposomen-Phospholipid-Doppelschicht ³ eingebracht werden. Einkapselung von Stoffen in wässrigen Inneren von Liposomen gewährt Schutz gegen Abbau in vivo und verhindert auch das Host-System von toxischen Wirkungen von Zytostatika für die Therapie von Krankheiten verwendet werden, zum Beispiel Chemotherapeutika auf die Zerstörung von Tumorzellen gerichtet. Die Modifikation der liposomalen Oberfläche mit Polymeren, wie Polyethylenglycol (PEGylierung) erweitert die liposomale Blutzirkulationszeit in vivo aufgrund sterischer Stabilisierung ^4. MoreovER, Liposomen können hohe Konzentrationen von mehreren Substanzen, wie Proteine ^​​5,6, hydrophilen Substanzen ^7,8 und Enzyme ⁹ sequestrieren. Sie dienen somit als zuverlässige klinische therapeutische und diagnostische Instrumente, die ihre Zustimmung für die Lieferung von Zytostatika verdienen wie Doxorubicin für die Krebstherapie ^4. Aufgrund ihrer Flexibilität können Liposomen auch mit Fluorochromen für diagnostische und bildgeführte chirurgische Zwecke geladen werden.

Fluoreszenz-Bildgebung liefert eine kostengünstige und nicht-invasive in vivo-Diagnosewerkzeug, erfordert jedoch einige grundlegende Anforderungen. Es konnte gezeigt werden, dass Fluoreszenzfarbstoffe, die am besten für die in-vivo-Bildgebung angepasst haben charakteristische Absorptions- und Emissionsmaxima im Bereich, wo Lichtverteilung und Streuung sowie Gewebeautofluoreszenz aus dem Wasser stamm und Hämoglobin ist gering. So haben solche Sonden ihre abs / em Maxima zwischen 650 und 900 nm ^10. Außerdem ist die Stabilität von Farbstoffen in vitro und in vivo kritisch, Opsonisierung und schnellen Clearance kann stark ihre Anwendung für die in vivo-Bildgebung ¹¹ begrenzen. Andere Effekte, wie geringe Stabilität und eine geringe Empfindlichkeit oder zytotoxische Wirkung auf Zielorgane wie Indocyaningrün (ICG) ^12-16 zu sehen ist, sind unerwünscht und müssen berücksichtigt werden, wenn Sonden für die in-vivo-Bildgebung genommen werden. Diese Beobachtungen haben zur Entwicklung von aktiven verschiedenen präklinischen NIR Fluorochrome, Nanopartikel sowie neue Techniken für die in vivo-Abbildung von Entzündungsprozessen, Krebs und für die bildgeführte Chirurgie ^17-20 geführt. Trotz der Stabilität der meisten präklinischen NIRF (Nah-Infrarot-Fluoreszenz) Farbstoffe in vitro, deren rasche Perfusion und Clearance durch die Leber und Nieren, behindern den Einsatz in der in-vivo-optischen Bildgebungs von Erkrankungen und entzündlichen Prozessen.

ntent "> Wir haben daher für die Einkapselung von Farbstoffen stellen ein Protokoll wie das gut charakterisiert Nahinfrarot-Fluoreszenzfarbstoff DY-676-COOH, das für seine Tendenz bei relativ hohen Konzentrationen ²¹ in Liposomen bekanntlich Selbst Quench. Bei hohen Konzentrationen H- Dimerbildung und / oder pi-Stapelwechselwirkungen zwischen Fluorophor-Moleküle innerhalb Förster-Radius Ergebnis des jeweils anderen in Förster-Resonanzenergietransfer (FRET) zwischen den Fluorochrommoleküle entfernt. Bei niedrigen Konzentration in den Raum zwischen den Fluorophor-Moleküle zu, wodurch pi-Stacking-Interaktion zu verhindern, und H-Dimerbildung und dadurch hohe Fluoreszenzemission. Der Wechsel zwischen hoher und niedriger Konzentration und dem begleitenden Fluoreszenzlöschung und die Aktivierung ist eine vielversprechende Strategie, die zur optischen Abbildung ²² ausgenutzt werden kann. In dieser Hinsicht, Verkapselung von hohen Konzentrationen an NIRF-Farbstoff DY-676-COOH in wäßrigen Innenraum von Liposomen ist fastigen für die in vivo-Bildgebung ist als der freie Farbstoff. Die Aufgabe des Verfahrens liegt vor allem in der richtigen Verkapselung und zweitens bei der Validierung der Vorteile aus Einkapseln hohen Konzentrationen des Farbstoffs resultiert. Vergleich der Abbildungseigenschaften des abgeschreckten Liposomen mit der des freien Farbstoffes und auch mit einem nicht-abgeschreckt Liposomenformulierung mit geringer Konzentration des Farbstoffs ist unverzichtbar. Wir zeigen durch eine einfache, aber sehr effektive Filmflüssigkeitszufuhr und Extrusions Protokoll in Verbindung mit alternativen Frost-Tau-Zyklen, die Verkapselung von Abschrecken Konzentrationen von DY-676-COOH in Liposomen möglich ist. Andere Methoden, um Liposomen herzustellen, wie die Umkehrphasenverdampfungsverfahren ²³ sowie der Ethanol-Injektionsmethode ²⁴ ermöglichen Liposomzubereitung mit hoher Einschlusseffizienz für viele hydrophile Substanzen. Allerdings ist die Art der zu verkapselnden Substanz können die Einkapselungseffizienz beeinflussen. TatsächlichDas hier vorgestellte Film Flüssigkeitszufuhr und Extrusions Protokoll ergeben, die höchste Effizienz für die Verkapselung von DY-676-COOH. Um die Vorteile der liposomalen Verkapselung von DY-676-COOH, einem Zymosan-induzierte Ödem-Modell, das die Untersuchung von Entzündungsprozessen innerhalb von einigen Stunden erlaubt illustrieren, wurde verwendet. Hier wird gezeigt, daß Liposomen mit einer hohen Konzentration des eingekapselten DY-676-COOH in vivo optische Bildgebung von Entzündungsprozessen als der freie Farbstoff oder das nicht-abgeschreckt Liposomenformulierung mit niedriger Farbstoffkonzentrationen besser geeignet für den ganzen Körper. So ist die zugrunde liegende Protokoll bietet eine einfache und schnelle Methode, um abgeschreckt fluoreszierende Liposomen und die Validierung ihrer Aktivierung und Bildgebung Potenzial sowohl in vitro als auch in vivo zu produzieren.

Protocol

HINWEIS: Alle Vorgänge werden von der regionalen Tierausschuss und im Einklang mit internationalen Leitlinien für die ethische Nutzung von Tieren zugelassen. 1. Herstellung der Materialien und Instrumente Vorbereitung der spontan gebildeten Vesikeldispersion (SFV) Auflösen und die Stammlösungen der folgenden Phospholipide: 214 mg / ml Ei-Phosphatidylcholin (EPC), 134 mg / ml Cholesterin, 122 mg / ml 1,2-Distearoyl–sn-glycero-3-phosphoethanolamine- N – [Metho…

Representative Results

Die Verkapselung von hohen Konzentrationen von fluoreszierenden Farbstoffen, wie den NIRF-Farbstoff DY676-COOH in wäßrigen Innenraum von Liposomen verwendet hier führt zu einem hohen Niveau der Fluoreszenzlöschung. Fluoreszenzlöschung, ein Phänomen mit vielen Fluorophoren in hoher Konzentration zu sehen ist, kann in verschiedenen in vivo-Abbildungsanwendungen, wo eine hohe Empfindlichkeit und eine zuverlässige Detektion des Zielgebiets gefordert werden ausgenutzt werden. Die Verwendung von Liposomen biet…

Discussion

Da Liposomen kann auch als Trägersysteme für Fluoreszenzfarbstoffe dienen, Abbildung von Zielkrankheiten ermöglichen sie. Die Verkapselung von hohen Konzentrationen von fluoreszierenden Farbstoffen, wie den NIRF-Farbstoff, DY676-COOH hier verwendet, führt zu einem hohen Maß an Fluoreszenzlöschung des eingeschlossenen Farbstoff. Fluoreszenzlöschung, ein Phänomen mit vielen Fluorophoren zu sehen in einer hohen Konzentration kann in verschiedenen in vivo-Abbildungsanwendungen, bei denen eine hohe Empfindli…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Materials and equipments for preparation of liposomes
egg phospahtidylcholine	Avanti Polar Lipids	840051P	Dissolve in Chloroform and store in glass vials (214 mg/ml)
cholesterol	Sigma	C8667	Dissolve in Chloroform and store in glass vials (134 mg/ml)
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt)	Avanti Polar Lipids	880120P	Dissolve in Chloroform and store in glass vials (122 mg/ml)
1,2-dioleoyl-snglycero-3-phosphoethanolamine-N-(7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl) (ammonium salt)	Avanti Polar Lipids	810145P	Dissolve in Chloroform and store in glass vials (2mg/ml)
Sartorius MC1 (d = 0.01 mg)	Sartorius AG	Research RC 210 P	used for weighing the phospholipids
Rotavapor	Büchi Labortechnik AG	R-114	used for hydration of phospholipid film
Waterbath	Büchi Labortechnik AG	R-481	used for hydration of phospholipid film
Vacuum Controller	Büchi Labortechnik AG	B-720	used for hydration of phospholipid film
Vacobox	Büchi Labortechnik AG	B-177	used for hydration of phospholipid film
Circulation Chiller	LAUDA DR. R. WOBSER GMBH & CO. KG	WKL 230	used for hydration of phospholipid film
DY-676-COOH	Dyomics GmbH	676-00	Dissolve in 10 mM Tris and store stock at -20°C
Tris-(Hydroxymethyl)-aminomethan	Applichem	A1086	buffer 10 mM, pH 7.4
Trichlormethan	Carl Roth GmbH + Co. KG	Y015.2	used for liposome preparation
Sonicator	Merck Eurolab GmbH	USR 170 H	used for liposome preparation
Vortex Genie 2 (Pop-off Cup, No. 146-3011-00)	Scientific Industries Inc.	SI-0256	used for liposome preparation
Sephadex G25 medium	GE Healthcare Europe GmbH	17-0033-01	used for liposome purification
Triton X100	Ferak Berlin GmbH	505002	used to destruct liposomes  for dye quantification
LiposoFast-Basic	Avestin Inc.		used for the extrusion of liposomes
Polycarbonate filter membrane, 100 nm (Whatman Nucleopore Trans Etch Membrane, NUCLEPR PC 19 MM, 0.1 U)	VWR		used for the extrusion of liposomes via LiposoFast-Basic
Fluostar Optima	BMG Labtech		used for dye quantification
Zetasizer Nano ZS	Malvern		used for the determination of liposome size and zetapotential
Ultracentrifuge	Beckmann Coulter GmbH	XL 80	used for concentration of the samples
Rotor	Beckmann Coulter GmbH	SW 55 TI	used for concentration of the samples
Materials and equipments for the evaluation of liposome and optical imaging
Zymosan-A from Saccharomyces cereviciae	Sigma	Z4250-250MG	used for induction of inflammation
Isotonic Saline (0.9)	Fresenius GmbH	PZN-2159621	used for the dilution of Zymosan-A
Isoflurane vaporizer	Ohmeda Isotec 4		used for anesthesizing animals
Isoflurane	Actavis GmbH	PZN-7253744	anesthesia
Thermo Mat Pro 20 W	Lucky Reptile	61202-HTP-20	used to keep animals warm during anesthesia
Omnican-F (1 ml injection)	Braun	PZN-3115465	used for subcutaneous and intravenous application of probes
Panthenol eye cream	Jenapharm	PZN-3524531	used to prevent dryness of the eyes of animals during anesthesia
Hanks buffered saline solution	PAA Laboratories /Biochrom AG	L2045	w/o Mg2+, Ca2+ and phenol red. For dilution of probes and for washing of cells
8-Well chamber slides	BD Biosciences	354108	used for cell culture followed by microscopy
Cell culture flasks	Greiner BioOne
Cell culture media	Gibco (life technologies GmbH)
Fetal calf serum	Invitrogen
Poly-L-Lysine solution (0,01% – 50 ml)	Sigma	P4832	used to coat cell culture chamber slides
Mountant Permafluor	ThermoScientific	S21022-3	Mounting solution for microscopy
Hoechst-33258	AppliChem		DNA stain for microscopy
Hera-Safe	Heraeus Instruments		sterile work bench used for cell culture
HERA cell	Heraeus Instruments		Incubator used for cell culture
LSM510-Meta	Zeiss		used for confocal microscopy
Maestro-TM in vivo fluorescence imaging system	CRi, Woburn		used for whole body fluorescence imaging of small animals
Spectrophotometer (Ultrospec 4300 pro UV)	GE Healthcare		used for measurement of absorption
Spectrofluorometer (Jasco FP-6200)	Jasco		used for measurement of fluorescence emission
Animals
NMRI mice (8-12 weeks old, male)	Elevage Janvier, France		used for inflammation trials