Fluorescens-slukking av en Liposomalinnkapslet Nær-infrarød fluoroforen som et verktøy for<em> I Vivo</em> Optisk Imaging

Summary

The use of fluorophores for in vivo imaging can be greatly limited by opsonization, rapid clearance, low detection sensitivity and cytotoxic effects on the host. Encapsulation of fluorophores in liposomes by film hydration and extrusion leads to fluorescence quenching and protection which enables in vivo imaging with high detection sensitivity.

Abstract

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous number of imaging techniques currently available and the progress in instrumentation, there is still a need for highly sensitive probes that are suitable for in vivo imaging. One typical problem of available preclinical fluorescent probes is their rapid clearance in vivo, which reduces their imaging sensitivity. To circumvent rapid clearance, increase number of dye molecules at the target site, and thereby reduce background autofluorescence, encapsulation of the near-infrared fluorescent dye, DY-676-COOH in liposomes and verification of its potential for in vivo imaging of inflammation was done. DY-676 is known for its ability to self-quench at high concentrations. We first determined the concentration suitable for self-quenching, and then encapsulated this quenching concentration into the aqueous interior of PEGylated liposomes. To substantiate the quenching and activation potential of the liposomes we use a harsh freezing method which leads to damage of liposomal membranes without affecting the encapsulated dye. The liposomes characterized by a high level of fluorescence quenching were termed Lip-Q. We show by experiments with different cell lines that uptake of Lip-Q is predominantly by phagocytosis which in turn enabled the characterization of its potential as a tool for in vivo imaging of inflammation in mice models. Furthermore, we use a zymosan-induced edema model in mice to substantiate the potential of Lip-Q in optical imaging of inflammation in vivo. Considering possible uptake due to inflammation-induced enhanced permeability and retention (EPR) effect, an always-on liposome formulation with low, non-quenched concentration of DY-676-COOH (termed Lip-dQ) and the free DY-676-COOH were compared with Lip-Q in animal trials.

Introduction

Liposomer har blitt intensivt undersøkt og tjener som en av de biokompatible biomedisinske medikamentleveringssystemer for kliniske anvendelser ^1,2. De er hovedsakelig sammensatt av fosfolipider og kolesterol, som begge er biokompatible forbindelser som etterligner deler av naturlige cellemembraner. Mens hydrofile stoffer kan bli innesluttet i det vandige indre, kan lipofile midler innarbeides i liposomalt fosfolipid dobbeltlag ^3. Innkapsling av stoffer i det vandige indre av liposomer gir beskyttelse mot degradering in vivo, og hindrer også at vertssystemet fra toksiske effekter av cytotoksiske medikamenter anvendt for behandling av sykdommer, for eksempel kjemoterapeutika som tar sikte på å ødelegge tumorceller. Modifikasjonen av den liposomale overflaten med polymerer som polyetylenglykol (PEGylering) videre strekker den liposomale blodsirkulasjonstiden in vivo på grunn av sterisk stabilisering ^4. Moreoveh, liposomer kan sekvestrere høye konsentrasjoner av flere stoffer slik som proteiner ^5,6, hydrofile substanser og enzymer ^{7,8 9.} De tjener derfor som pålitelige kliniske terapeutiske og diagnostiske verktøy som fortjener sin godkjenning for levering av cytotoksiske legemidler som doxorubicin for kreftbehandling ^4. På grunn av sin fleksibilitet, kan liposomer også være lastet med fluorokromer for diagnostiske og bildestyrt kirurgi formål.

Fluorescens bildebehandling gir en kostnadseffektiv og ikke-invasiv in vivo diagnostisk verktøy som imidlertid krever noen grunnleggende krav. Det kunne påvises at fluorokromer som passer best for in vivo avbildning har karakteristisk absorpsjon og emisjon maksima i området hvor lysspredning og spredning, så vel som vev autofluorescens som stammer fra vann og hemoglobin er lav. Dermed slike sonder har sin abs / em maxima mellom 650 og 900 nm ^10. I tillegg til dette, er stabiliteten av fluorokromer både in vitro og in vivo kritisk, som opsonisering og rask klaring kan i stor grad begrenser deres anvendelse for in vivo avbildning ^11. Andre effekter som dårlig stabilitet og lav følsomhet eller cytotoksiske effekter på målorganer som sett med indocyanine grønn (ICG) ^12-16, er uønsket og må tas hensyn til ved utformingen av sonder for in vivo imaging. Disse observasjonene har ført til aktiv utvikling av flere prekliniske NIR fluorokromer, nanopartikler samt nye teknikker for in vivo avbildning av inflammatoriske prosesser, kreft og for bildestyrt kirurgi ^17-20. Til tross for stabiliteten av de prekliniske NIRF (nær infrarød fluorescens) fargestoffer som in vitro, er deres hurtige perfusjon og klaring gjennom leveren og nyrene hindrer deres anvendelse i in vivo optisk avbildning av sykdommer og inflammatoriske prosesser.

ntent "> Vi vil derfor presentere en protokoll for innkapsling av fluorokromer slik som godt karakterisert nær-infrarøde fluorescerende fargestoff DY-676-COOH som er kjent for sin tendens til å selv-avkjølings ved relativt høye konsentrasjoner ²¹ i liposomer. Ved høye konsentrasjoner H- dimer-dannelse og / eller pi-stabling interaksjoner mellom fluoroformolekyler som befinner seg innenfor hverandres Förster radius resultat Forster resonans energioverføring (FRET) mellom fluorokromkonjugerte molekyler. Ved lav konsentrasjon rommet mellom fluoroformolekyler øker, for derved å hindre pi-stabling interaksjon og H-dimer-dannelse og som resulterer i høy fluorescensemisjonen. Bryteren mellom høy og lav konsentrasjon, og det medfølgende fluorescensslukking og aktivisering er en lovende strategi som kan utnyttes for optisk avbildning ^22. I dette henseende, innkapsling av høye konsentrasjoner av NIRF fargestoff DY-676-COOH i den vandige indre av liposomer er flere favorable for in vivo avbildning enn den gratis fargestoff. Utfordringen av metoden ligger først og fremst i riktig innkapsling og for det andre, i valideringen av fordelene som følger av innkapsle høye konsentrasjoner av fargestoffet. Sammenligning av de bildedannende egenskaper av bråtilsatt liposomer med det av den frie fargestoff og også med en ikke-undertrykket liposomformulering med lave konsentrasjoner av fargestoffet er uunnværlig. Vi viser av en enkel, men svært effektive film hydrering og ekstrudering protokoll kombinert med alternative fryse og tinesykluser som innkapsling av slukke konsentrasjoner av DY-676-COOH i liposomer er gjennomførbart. Andre metoder som brukes for å fremstille liposomer for eksempel revers fase fordamping metode ²³ samt etanolinjeksjonsmetoden ²⁴ aktiverer liposompreparat med høye innkapslingseffektiviteter for mange hydrofile stoffer. Imidlertid arten av den substans som skal innkapsles kan påvirke innkapslingseffektivitet. I praksisfilmen hydrering og ekstrudering protokollen presenteres her avslørte den høyeste effektivitet for innkapsling av DY-676-COOH. For å illustrere fordelene ved liposomal innekapsling av DY-676-COOH, en zymosan-induserte ødemmodell, som tillater undersøkelse av inflammatoriske prosesser innen noen få timer, ble anvendt. Her er det vist at liposomer med høye konsentrasjoner av den innkapslede DY-676-COOH er mer egnet for hele kroppen in vivo optisk avbildning av inflammatoriske prosesser enn det frie fargestoff eller den ikke-undertrykket liposomal formulering med lav fargestoffkonsentrasjoner. Således underliggende protokoll gir en enkel og rask metode for å produsere slukket fluorescerende liposomer og validering av deres aktivering og avbildning potensial både in vitro og in vivo.

Protocol

MERK: Alle prosedyrer er godkjent av regional dyr komiteen og i samsvar med internasjonale retningslinjer for etisk bruk av dyr. 1. Utarbeidelse av materialer og instrumenter Utarbeidelse av spontant dannet vesikkel spredning (SFV) Oppløs og forberede stamoppløsninger med følgende fosforlipider: 214 mg / mL Egg-fosfatidylkolin (EPC), 134 mg / ml kolesterol, 122 mg / ml 1,2-distearoyl- sn -glycero-3-phosphoethanolamine- N – [metoksy (polyethylen glykol…

Representative Results

Innkapslingen av høye konsentrasjoner av fluorescerende fargestoffer som NIRF fargestoff DY676-COOH anvendes her i den vandige indre av liposomene fører til en høy grad av fluorescensslukking. Fluorescensslukking, et fenomen sett med mange fluoroforene ved høy konsentrasjon, kan utnyttes i flere in vivo bildebehandlingsprogrammer der en høy følsomhet og pålitelig deteksjon av målområdet er etterspurt. Bruken av liposomer gir også beskyttelse av fargestoffet som er uunnværlig for in vivo<…

Discussion

Siden liposomer kan også tjene som leveringssystemer for fluorescerende fargestoffer, aktiverer de avbildning av målet sykdommer. Innkapslingen av høye konsentrasjoner av fluorescerende fargestoffer som NIRF fargestoff, DY676-COOH anvendes her, fører til en høy grad av fluorescensslukking av innesluttet fargestoff. Fluorescensslukking, et fenomen sett med mange fluoroforene ved høy konsentrasjon kan utnyttes i flere in vivo bildebehandlingsprogrammer, hvor en høy følsomhet og pålitelig deteksj…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Materials and equipments for preparation of liposomes
egg phospahtidylcholine	Avanti Polar Lipids	840051P	Dissolve in Chloroform and store in glass vials (214 mg/ml)
cholesterol	Sigma	C8667	Dissolve in Chloroform and store in glass vials (134 mg/ml)
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt)	Avanti Polar Lipids	880120P	Dissolve in Chloroform and store in glass vials (122 mg/ml)
1,2-dioleoyl-snglycero-3-phosphoethanolamine-N-(7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl) (ammonium salt)	Avanti Polar Lipids	810145P	Dissolve in Chloroform and store in glass vials (2mg/ml)
Sartorius MC1 (d = 0.01 mg)	Sartorius AG	Research RC 210 P	used for weighing the phospholipids
Rotavapor	Büchi Labortechnik AG	R-114	used for hydration of phospholipid film
Waterbath	Büchi Labortechnik AG	R-481	used for hydration of phospholipid film
Vacuum Controller	Büchi Labortechnik AG	B-720	used for hydration of phospholipid film
Vacobox	Büchi Labortechnik AG	B-177	used for hydration of phospholipid film
Circulation Chiller	LAUDA DR. R. WOBSER GMBH & CO. KG	WKL 230	used for hydration of phospholipid film
DY-676-COOH	Dyomics GmbH	676-00	Dissolve in 10 mM Tris and store stock at -20°C
Tris-(Hydroxymethyl)-aminomethan	Applichem	A1086	buffer 10 mM, pH 7.4
Trichlormethan	Carl Roth GmbH + Co. KG	Y015.2	used for liposome preparation
Sonicator	Merck Eurolab GmbH	USR 170 H	used for liposome preparation
Vortex Genie 2 (Pop-off Cup, No. 146-3011-00)	Scientific Industries Inc.	SI-0256	used for liposome preparation
Sephadex G25 medium	GE Healthcare Europe GmbH	17-0033-01	used for liposome purification
Triton X100	Ferak Berlin GmbH	505002	used to destruct liposomes  for dye quantification
LiposoFast-Basic	Avestin Inc.		used for the extrusion of liposomes
Polycarbonate filter membrane, 100 nm (Whatman Nucleopore Trans Etch Membrane, NUCLEPR PC 19 MM, 0.1 U)	VWR		used for the extrusion of liposomes via LiposoFast-Basic
Fluostar Optima	BMG Labtech		used for dye quantification
Zetasizer Nano ZS	Malvern		used for the determination of liposome size and zetapotential
Ultracentrifuge	Beckmann Coulter GmbH	XL 80	used for concentration of the samples
Rotor	Beckmann Coulter GmbH	SW 55 TI	used for concentration of the samples
Materials and equipments for the evaluation of liposome and optical imaging
Zymosan-A from Saccharomyces cereviciae	Sigma	Z4250-250MG	used for induction of inflammation
Isotonic Saline (0.9)	Fresenius GmbH	PZN-2159621	used for the dilution of Zymosan-A
Isoflurane vaporizer	Ohmeda Isotec 4		used for anesthesizing animals
Isoflurane	Actavis GmbH	PZN-7253744	anesthesia
Thermo Mat Pro 20 W	Lucky Reptile	61202-HTP-20	used to keep animals warm during anesthesia
Omnican-F (1 ml injection)	Braun	PZN-3115465	used for subcutaneous and intravenous application of probes
Panthenol eye cream	Jenapharm	PZN-3524531	used to prevent dryness of the eyes of animals during anesthesia
Hanks buffered saline solution	PAA Laboratories /Biochrom AG	L2045	w/o Mg2+, Ca2+ and phenol red. For dilution of probes and for washing of cells
8-Well chamber slides	BD Biosciences	354108	used for cell culture followed by microscopy
Cell culture flasks	Greiner BioOne
Cell culture media	Gibco (life technologies GmbH)
Fetal calf serum	Invitrogen
Poly-L-Lysine solution (0,01% – 50 ml)	Sigma	P4832	used to coat cell culture chamber slides
Mountant Permafluor	ThermoScientific	S21022-3	Mounting solution for microscopy
Hoechst-33258	AppliChem		DNA stain for microscopy
Hera-Safe	Heraeus Instruments		sterile work bench used for cell culture
HERA cell	Heraeus Instruments		Incubator used for cell culture
LSM510-Meta	Zeiss		used for confocal microscopy
Maestro-TM in vivo fluorescence imaging system	CRi, Woburn		used for whole body fluorescence imaging of small animals
Spectrophotometer (Ultrospec 4300 pro UV)	GE Healthcare		used for measurement of absorption
Spectrofluorometer (Jasco FP-6200)	Jasco		used for measurement of fluorescence emission
Animals
NMRI mice (8-12 weeks old, male)	Elevage Janvier, France		used for inflammation trials