で微小管ダイナミクスを測定するためにplusTipTrackerソフトウェアを使用した<em>アフリカツメガエル</em>成長円錐
Summary
MATLABベースのオープンソースソフトウェアパッケージ、plusTipTrackerは、微小管動態を定量するために蛍光標識+先端の画像シリーズを分析するために使用することができる。
Abstract
微小管（MT）プラスエンド追跡タンパク質（+ヒントは）MTの成長プラス端に局在し、MTのダイナミクス1,2を調節する。最もよく知られており、MT動態を分析するため+広く利用されるチップの一つは、全ての成長MTプラス端を結合するエンドの結合タンパク質EB1、であり、従って、MTの重合1のマーカーである。成長円錐内のEB1の挙動の多くの研究は、個別のMT 1-3を分析するために時間がかかり、バイアスされたコンピュータ支援、手追跡の方法を使用している。私たちのアプローチは、培養された胚の成長円錐5におけるタグ付きEB1の高解像度、ライブ画像の取得以下、plusTipTracker 4、ソフトウェアパッケージを使用して、MTダイナミクスのグローバルパラメータを定量化することである。このソフトウェアは、蛍光標識された+チップの映画のための自動検出、追跡、可視化、および分析を組み合わせた、MATLABベースの、オープンソースの、ユーザーフレンドリーなパッケージです。ここでは、plusTipTを使用するためのプロトコルを提示する培養されたアフリカツメガエルの成長円錐での蛍光標識+ヒント彗星の分析のためのラッカー。しかし、このソフトウェアは、さまざまな細胞タイプ6-8のMT動態を特徴付けるために使用することができる。
Introduction
この方法の目的は、生きた成長円錐微小管（MT）プラスエンド追跡タンパク質（+ TIP）ダイナミクスに関する定量的情報を得ることである。 MT +ヒントはMTが9,10のプラス両端に局在するタンパク質の一群である。彼らは、重合、大災害、救助のレートを含むMT動的不安定11のパラメータを調整するためにさまざまな機能を実行します。 MTのダイナミクスを分析するための1つのよく使用される方法は、MT 1,12プラス終わる成長に特異的に結合する+ヒントのEB1の行動を追跡することである。 EB1は13,14をプラス終了し、最近では、MTの成長と破局周波数15,16の両方を促進し、MT成熟因子15として確立されている。成長しているMTにいくつかの他のタンパク質を動員することが知られている
成長円錐内のMTダイナミクスの多くの研究がEB1のlocalizatiように時間1-3オーバーEB1-GFPのダイナミクスの変化を測定するために手の追跡方法を利用しているMT上にプラスの端部は、MTの重合のためのマーカーとして使用することができる。 MTの成長のためのプロキシとしてEB1-GFP彗星を調べるための主な利点は、MT動態でも有意なMTの重複領域で測定することができることである。ハンドトラッキングEB1-GFP彗星の方法は、MTに有用な洞察を提供してきたが1-3ビヘイビア 、それは時間がかかり、バイアスすることができる。さらに、異常な成長円錐の行動はMTの小さなサブセットのみを分析し、可能性が高い細胞骨格のダイナミクスの微小シフトの結果であるように（通常は必要に応じて手でトラッキング）重要な情報を見逃すことがあります。
そこで、高解像度、培養された胚の成長円錐5でタグ付けされたEB1のライブ画像を取得した後、ソフトウェアパッケージ、plusTipTracker 4を使用してグローバルMT動態パラメータを測定する。 Danuser研究室で開発されたこのソフトウェアは、さまざまな細胞型6-8のMT動態を特徴付けるいくつかの研究で使用されている。それは、私たちのオープンソースであるERに優しい、蛍光標識+チップの映画のための自動検出、追跡、可視化、分析が含まれ、MATLABベースのパッケージ。 MT力学の特定のパラメータは、このソフトウェアによって計算されたの長いリストが（詳細は文献4を参照）、成長円錐のMTダイナミクスの解析のために、最も有用なパラメータは（ミクロン/分で）MT成長軌道速度である、成長軌道（秒単位）、寿命、および（ミクロン単位）成長軌道の長さ。ソフトウェアは、（「ソフトウェア」の下）DanuserラボのWebサイトから直接ダウンロードすることができます。 Danuser Labは現在、2.0のu-トラックと呼ばれるソフトウェアパッケージに組み込まれている+ TIPのトラッキング分析のための新しいインターフェースをサポートしていますが、オリジナルの、スタンドアローンのソフトウェアが利用可能なままになります。二つのプログラムの間に根本的なアルゴリズムは、インターフェースや分析出力の唯一の違いは、（少なくとも2014年現在）と同じである。少しMATLABおよび/または計算分析experiと初心者ユーザーのためにレンスは、plusTipTrackerは、自動化された統計的パラメータ出力など、よりユーザーフレンドリーな機能を備えています。
ここでは、培養されたアフリカツメガエルの成長円錐にEB1-GFPダイナミクスの画像を分析するための手順を説明します。このプロトコルは、MTのダイナミクス17を検査する最近の論文で利用した。 EB1-GFPを発現する培養成長円錐に関する詳細手順については、ロウリーら 2012 5をも参照してください。この論文は、主に成長円錐におけるEB1-GFP動態を調べることに焦点を当てているが、同一のプロトコルは、他の細胞型17のために使用することができる。全ての細胞型では、フレーム間の時間間隔は、最適+ヒント追跡のための0.5〜2秒の間であるべきである。フレーム間の最大4秒の時間間隔が可能であるが、これは、追加の追跡誤差のインターバル時間の結果を増加させた。
Protocol
Representative Results
Discussion
PlusTipTrackerを迅速かつ自動的に、細胞または成長円錐において、実質的にすべての可視EB1-GFP彗星を検出するトラックに彗星をリンクし、MTパラメータを計算する簡単なグラフィカルユーザインタフェースを提供する。その他の刊行物は、（例えば、マルクスら成長円錐18内のタグ付けされたEB1ダイナミクスのもまた利用定量分析）ソフトウェア同様のタイプの設計を報告してい…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. Gaudenz Danuser and members of his lab for creating the plusTipTracker software and for helpful discussion regarding using the software, in particular Maria Bagonis and Sebastien Besson. We especially thank the Boston College Media Center for their assistance and support in the creation and editing of the video. We also thank members of the Lowery Lab for useful discussions and constructive criticism, and Abigail Antoine for proof-reading the manuscript. This work was funded by an NIH R00 MH095768 award to LAL.
Materials
| plusTipTracker software | Danuser Lab | http://lccb.hms.harvard.edu/software.html | This software may be hosted by another website in the future. If the listed site does not exist, search "Danuser Lab Software" on a web search engine to find the site. |
| Matlab software | Mathworks | http://www.mathworks.com/products/matlab/ |
References
- Stepanova, T., et al. Visualization of microtubule growth in cultured neurons via the use of EB3-GFP (end-binding protein 3-green fluorescent protein). The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 23, 2655-2664 (2003).
- Lee, H., et al. The microtubule plus end tracking protein Orbit/MAST/CLASP acts downstream of the tyrosine kinase Abl in mediating axon guidance. Neuron. , 913-926 (2004).
- Purro, S. A., et al. Wnt regulates axon behavior through changes in microtubule growth directionality: a new role for adenomatous polyposis coli. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 28, 8644-8654 (2008).
- Applegate, K. T., et al. plusTipTracker: Quantitative image analysis software for the measurement of microtubule dynamics. Journal of structural biology. 176, 168-184 (2011).
- Lowery, L. A., Faris, A. E., Stout, A., Van Vactor, D. Neural Explant Cultures from Xenopus laevis. Journal of visualized experiments : JoVE. (68), e4232 (2012).
- Long, J. B., et al. Multiparametric analysis of CLASP-interacting protein functions during interphase microtubule dynamics. Molecular and cellular biology. 33, 1528-1545 (2013).
- Myers, K. A., Applegate, K. T., Danuser, G., Fischer, R. S., Waterman, C. M. Distinct ECM mechanosensing pathways regulate microtubule dynamics to control endothelial cell branching morphogenesis. The Journal of cell biology. 192, 321-334 (2011).
- Nishimura, Y., Applegate, K., Davidson, M. W., Danuser, G., Waterman, C. M. Automated screening of microtubule growth dynamics identifies MARK2 as a regulator of leading edge microtubules downstream of Rac1 in migrating cells. PLoS One. 7, e41413 (2012).
- Akhmanova, A., Steinmetz, M. O. Tracking the ends: a dynamic protein network controls the fate of microtubule tips. Nature reviews. Molecular cell biology. 9, 309-322 (2008).
- Schuyler, S. C., Pellman, D. Microtubule ‘plus-end-tracking proteins’: The end is just the beginning. Cell. 105, 421-424 (2001).
- Mitchison, T., Kirschner, M. Dynamic instability of microtubule growth. Nature. 312, 237-242 (1984).
- Mimori-Kiyosue, Y., Shiina, N., Tsukita, S. The dynamic behavior of the APC-binding protein EB1 on the distal ends of microtubules. Current biology : CB. 10, 865-868 (2000).
- Dixit, R., et al. Microtubule plus-end tracking by CLIP-170 requires EB1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 492-497 (2009).
- Li, W., et al. EB1 promotes microtubule dynamics by recruiting Sentin in Drosophila cells. The Journal of cell biology. 193, 973-983 (2011).
- Maurer, S. P., et al. EB1 accelerates two conformational transitions important for microtubule maturation and dynamics. Current biology : CB. 24, 372-384 (2014).
- Zanic, M., Widlund, P. O., Hyman, A. A., Howard, J. Synergy between XMAP215 and EB1 increases microtubule growth rates to physiological levels. Nature cell biology. 15, 688-693 (2013).
- Lowery, L. A., et al. Growth cone-specific functions of XMAP215 in restricting microtubule dynamics and promoting axonal outgrowth. Neural development. 8, 22 (2013).
- Marx, A., et al. Xenopus cytoplasmic linker-associated protein 1 (XCLASP1) promotes axon elongation and advance of pioneer microtubules. Molecular biology of the cell. 24, 1544-1558 (2013).
