Nevrale stamcelletransplantasjon i Experimental Contusive Modell av ryggmargsskade
Summary
Ryggmargsskade er en traumatisk tilstand som forårsaker alvorlig sykelighet og høy dødelighet. I dette arbeidet vil vi beskrive i detalj en -kontusjon modell av ryggmargsskade i mus etterfulgt av en transplantasjon av nevrale stamceller.
Abstract
Ryggmargsskade er en ødeleggende klinisk tilstand, preget av et kompleks av nevrologiske dysfunksjoner. Dyremodeller av ryggmargskade kan brukes både for å undersøke de biologiske responser på skade og for å teste potensielle terapier. Kontusjon eller kompresjonsskade levert til kirurgisk eksponert ryggmarg er de mest brukte modeller av patologi. I denne rapporten den eksperimentelle kontusjon er utført ved hjelp av Infinite Horizon (IH) Impactor enhet, som tillater etablering av en reproduserbar skade dyremodell gjennom definisjon av spesifikke skader parametere. Stamcelletransplantasjon er ofte betraktet som en potensielt nyttig strategi for herding denne ødeleggende tilstanden. Tallrike studier har evaluert effekten av transplantasjonen en rekke av stamceller. Her viser vi en tilpasset metode for ryggmargsskader etterfulgt av halevenen injeksjon av celler i CD1 mus. Kort sagt, vi gir prosedyrer for: i) celle merking with en viktig sporstoff, ii) pre-operativ behandling av mus, iii) gjennomføring av en contusive ryggmargsskade, og iv) intravenøs administrering av post mortem nevrale forløpere. Dette kontusjon modellen kan benyttes til å evaluere effekt og sikkerhet av stamcelletransplantasjon i en regenerativ medisin tilnærming.
Introduction
En ryggmargsskade (SCI) er den vanligste skaden forårsaket av høy energi traumer som motorkjøretøy ulykker, fall, sport og vold en. Ved alvorlig SCI, ødelegger skade kraft eller skader nevrale vev, forårsaker plutselig tap av nevrologisk funksjon. Traumatisk ryggmargsskade oppstår ofte hos unge voksne mellom 10 og 40 år. Det påvirker i stor grad pasientens psykiske og fysiske tilstand og fører til enorme økonomiske konsekvenser for samfunnet 2. Behandlingen tilnærming i den akutte fasen er ofte begrenset til en høy dose med kortikosteroider, kirurgisk stabilisering og dekompresjon å muligens dempe ytterligere skade 3-4, men rollene til disse metodene på bevegelses utvinning etter SCI er fortsatt kontroversielt. I tillegg til akutt vev tap, den traumatiske skader og aktivering av sekundære mekanismer for degenerasjon årsak demyelinisering og død av flere celletyper 5-6. Graden av gjenvinning av funksjon kan avti være korrelert til omfanget av spart hvit substans på skadestedet 7.
Dyremodeller av SCI kan brukes både for å undersøke de biologiske responsene til vev mot skade og for å teste potensielle terapier. Dessuten har en nyttig dyremodell av en human patologi ikke bare å gjengi noen aspekter av denne tilstand, men må også gi fordeler fremfor direkte klinisk observasjon og eksperiment. De mest brukte modeller av ryggmargsskade involvere kontusjon eller kompresjonsskade levert til kirurgisk eksponert ryggmarg 8. Utviklingen av en kontrollert vekt-slipp kontusjon skade representerer en viktig milepæl i historien av SCI forskning. The Ohio State University ryggmarg forskningssenter har fulgt den teknologiske utfordringen med en enhet som kan brukes til å fremkalle en bestemt kompresjon av ryggmargen med parametere for påvirkning som kontrolleres av en datamaskin 9. Dette ble opprinnelig utviklet for bruk with rotter; senere ble endret til å gjelde mot mus 10. Fordelene med en slik tilnærming er at de biomekaniske av skade kan studeres mer i dybden og parameterne for skade kan defineres på en mer fullstendig måte for å oppnå en reproduserbar eksperimentell modell, og derfor tillater en mer nøyaktig evaluering av virkningene av testet behandlinger på funksjonell gjenopprettingsprosessen.
Mange studier har evaluert transplantasjons virkningene av en rekke av stamceller i SCI-modeller 11. Vi har nylig isolert voksen nevrale stamceller fra under Ventrikulært Zone (SVZ) flere timer etter døden av musen donor 12-13. Denne fremgangsmåten gir en populasjon av nevrale stamceller, kalles post mortem nevrale forløpere (PM-NPC), som synes å være fordelaktig i en regenerativ medisin tilnærming for herding SCI. I denne artikkelen vil vi demonstrere: i) protokollen for celle merking med den vitale tracer PKH26, ii) Surgical prosedyre å utføre på traumatisk ryggmargsskade, og iii) intravenøs (iv) administrasjon av merkede celler. Videre i dette arbeidet viser vi at transplanterte cellene migrerer til ryggmargs lesjon nettsteder og differensiere stort sett inn microtubule assosiert protein (MAP) 2 positive celler. Videre er differensieringen ledsages av å fremme et stabilt utvinning av bakben funksjon.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denne artikkelen beskrives vi en fremgangsmåte til å oppnå en reproduserbar modell av traumatisk ryggmargsskade ved hjelp av en uendelig Horizon Impactor ved en kraft på 70 Kdyne (alvorlig). Ved hjelp av en større kraft paradigmet (80 Kdyne), kan vi føre en mer alvorlig skade som dessverre er assosiert med høyere mus dødelighet. For å unngå dette problemet, vi vanligvis velge en moderat kraft paradigmet (70 Kdyne) som er knyttet til en repeat lesjon med en gradvis bedring av funksjon og lavere dødelighet. F…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The Authors acknowledge the economic support by FAIP (Federazione Associazioni Italiane Paraplegici), “Neurogel-en-Marche” Foundation (France), Fondazione “La Colonna”.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| PKH26GL-1KT | Sigma | 091M0973 | |
| Infinite horizon (IH) Impactor device | Precision Systems and Instrumentation, LLC | Model 0400 Serial 0171 | |
| Gentamycin 10mg/ml | Euroclone | ECM0011B | 1mg/ml in sterile saline solution |
| Isoflurane-Vet 250ml | Merial | B142J12A | |
| Blefarolin POM OFT 10g | |||
| Slide Warmer | 2Biological Instruments | HB101-sm-402 | |
| Scalpel, size 10 | Lance Paragon | 26920 | |
| Small Graefe Forceps | 2Biological Instruments | 11023-14 | |
| Rongeur | Medicon Instruments | 07 60 07 | |
| Micro scissors | 2Biological Instruments | 15000-00 | |
| Absorbable sutures (4/0) | Safil Quick | C0046203 | |
| Hemostat | 2Biological Instruments | 13014-14 | |
| Reflex 7 wound clip applicator | 2Biological Instruments | 12031-07 | |
| 7mm Reflex wound clips | 2Biological Instruments | 12032-07 | |
| NGS | Euroclone | ECS0200D | |
| Triton X 100 | Merck Millipore | 1086431000 | |
| Anti Microtubule Assocoated Protein (MAP) 2 | Millipore | AB5622 | |
| Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11008 | |
| FluorSave Reagent | Calbiochem | 345789 | |
| Neural stem cells medium | DMEM-F12 medium (Euroclone) containing 2 mm l-glutamine (Euroclone), 0.6% glucose (Sigma-Aldrich), 9.6 gm/ml putrescine (Sigma-Aldrich), 6.3 ng/ml progesterone (Sigma-Aldrich), 5.2 ng/ml sodium selenite (Sigma-Aldrich), 0.025 mg/ml insulin (Sigma-Aldrich), 0.1 mg/ml transferrin (Sigma-Aldrich), and 2 μg/ml heparin (sodium salt, grade II; Sigma-Aldrich), bFGF (human recombinant, 10 ng/mL; Life Technologies) and EGF (human recombinant, 20 ng/mL; Life Technologies) | ||
| DMEM-F12 | Euroclone | ASM5002 | |
| l-glutamine | Euroclone | ECB3000D | |
| glucose | Sigma-Aldrich | G8270-100G | |
| putrescine | Sigma-Aldrich | P5780-25G | |
| progesterone | Sigma-Aldrich | P6149-1MG | |
| Sodium-selenite | Sigma-Aldrich | S9133-1MG | |
| transferrin | Sigma-Aldrich | T 5391 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I1882 | |
| Heparin sodium-salt | Sigma-Aldrich | H0200000 | |
| bFGF | Life Technology | PHG0024 | |
| h-EGF | Life Technology | PHG6045 | |
| Syringe 0.33cc 29G | Terumo | MYJECTOR | |
| buprenorphine | Schering Plough SpA | TEMGESIC | |
| eye gel | Bausch & Lomb | LIPOSIC |
References
- . Cord Injury Statistical Center: spinal cord injury facts and figures at glance Available from: https://www.nscisc.uab.edu/PublicDocuments/fact_figures_docs/Facts%202013.pdf (2013)
- Yip, P. K., Malaspina, A. Spinal cord trauma and the molecular point of no return. Molecular Neurodegeneration. 7, 6 (2012).
- Fehlings, M. G., Cadotte, D. W., Fehlings, L. N. A series of systematic reviews on the treatment of acute spinal cord injury: a foundation for best medical practice. J Neurotrauma. 28 (8), 1329-1333 (2011).
- Furlan, J. C., Noonan, V., Cadotte, D. W., Fehlings, M. G. Timing of decompressive surgery of spinal cord after traumatic spinal cord injury: an evidence-based examination of pre-clinical and clinical studies. J Neurotrauma. 28 (8), 1371-1399 (2011).
- Sekhon, L. H., Fehlings, M. G. Epidemiology, demographics, and pathophysiology of acute spinal cord injury. Spine. 26 (24), 2-12 (2001).
- Gorio, A., et al. Recombinant human erythropoietin counteracts secondary injury and markedly enhances neurological recovery from experimental spinal cord trauma. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (14), 9450-9455 (2002).
- Windle, W. F., Clemente, C. D., Chambers, W. W. Inhibition of formation of a glial barrier as a means of permitting a peripheral nerve to grow into the brain. J Comp Neurol. 96 (2), 359-369 (1952).
- Young, W. Spinal cord contusion models. Prog Brain Res. 137, 231-255 (2002).
- Stokes, B. T., Noyes, D. H., Behrmann, D. L. An electromechanical spinal injury device with dynamic sensitivity. J Neurotrauma. 9 (3), 187-195 (1992).
- Jakeman, L. B., et al. Traumatic spinal cord injury produced controlled contusion in mouse. J Neurotrauma. 17 (4), 299-319 (2000).
- Sahni, V., Kessler, J. A. Stem cell therapies for spinal cord injury. Nat Rev Neurol. 6, 363-372 (2010).
- Marfia, G., et al. Adult neural precursors isolated from post mortem brain yield mostly neurons: an erythropoietin-dependent process. Neurobiol Dis. 43 (1), 86-98 (2011).
- Gritti, A., et al. Multipotent neural stem cells reside into the rostral extension and olfactory bulb of adult rodents. J Neurosci. 22 (2), 437-445 (2002).
- Whetstone, W. D., Hsu, J. Y., Eisenberg, M., Werb, Z., Noble-Haeusslein, L. J. . J Neurosci Res. 74 (2), 227-239 (2003).
- Gonzalez-Lara, L. E., et al. The use of cellular magnetic resonance imaging to track the fate of iron-labeled multipotent stromal cells after direct transplantation in a mouse model of spinal cord injury. Mol Imaging Biol. 13 (4), 702-711 (2010).
- Ottobrini, L., et al. Magnetic resonance imaging of stem cell transplantation in injured mouse spinal cord. Cell R4. 2 (3), e963 (2014).
- Janowwski, M., et al. Neurotransplantation in mice: The concorde-like position ensures minimal cell leakage and widespread distribution of cells transplanted into the cistern magna. Neuroscience Letter. 430 (2), 169-174 (2008).
- Basso, D. M., et al. Basso Mouse Scale for locomotion detects differences in recovery after spinal cord injury in five common mouse strains. J Neurotrauma. 23 (5), 635-659 (2006).
- Hofstetter, C. P., et al. Allodynia limits the usefulness of intraspinal neural stem cell grafts; directed differentiation improves outcome. Nat Neurosci. 8 (3), 346-353 (2005).
- Bottai, D., Madaschi, L., Di Giulio, A. M., Gorio, A. Viability-dependent promoting action of adult neural precursors in spinal cord injury. Mol. Med. 14 (9-10), 634-644 (2008).
- Bottai, D., et al. Embryonic stem cells promote motor recovery and affect inflammatorycell infiltration in spinal cord injured mice. Exp Neurol. 223 (2), 452-463 (2010).
