Gene targeting methodologies can be used to generate transgenic mice with knockout, knock-in and tagged alleles. Here, we describe an improved method of recombineering in E. coli, that we term ‘subcloning plus insertion’, which can be used to generate custom gene targeting vectors rapidly.
Gene targeting refers to the precise modification of a genetic locus using homologous recombination. The generation of novel cell lines and transgenic mouse models using this method necessitates the construction of a ‘targeting’ vector, which contains homologous DNA sequences to the target gene, and has for many years been a limiting step in the process. Vector construction can be performed in vivo de Escherichia coli cells using homologous recombination mediated by phage recombinases using a technique termed recombineering. Recombineering is the preferred technique to subclone the long homology sequences (>4kb) and various targeting elements including selection markers that are required to mediate efficient allelic exchange between a targeting vector and its cognate genomic locus. Typical recombineering protocols follow an iterative scheme of step-wise integration of the targeting elements and require intermediate purification and transformation steps. Here, we present a novel recombineering methodology of vector assembly using a multiplex approach. Plasmid gap repair is performed by the simultaneous capture of genomic sequence from mouse Bacterial Artificial Chromosome libraries and the insertion of dual bacterial and mammalian selection markers. This subcloning plus insertion method is highly efficient and yields a majority of correct recombinants. We present data for the construction of different types of conditional gene knockout, or knock-in, vectors and BAC reporter vectors that have been constructed using this method. SPI vector construction greatly extends the repertoire of the recombineering toolbox and provides a simple, rapid and cost-effective method of constructing these highly complex vectors.
Udviklingen af gen-targeting teknologier har muliggjort konstruktionen af cellelinjer og musemodeller at undersøge forskellige biologiske systemer 1-3. En vigtig første etape i ændringen af en genomisk sekvens er design og konstruktion af et gen targeting vektor 4. Targeting vektorer er plasmidkonstruktioner der bærer allel af interesse, der indeholder de ønskede ændringer (s) flankeret af en selektionsmarkør (fx neomycin), og lange genomiske regioner nødvendige for effektiv homolog rekombination i pattedyrceller 5. Præcis genetiske modifikation opnås ved indførelse af targeting vektoren ind i embryonale stamceller (ES-celler) 6 eller somatiske celler 7, hvorved homolog rekombination mellem identiske strækninger af DNA-sekvens på targeting vektoren og genomiske locus resulterer i overførsel af den tilsigtede ændring til genomet ved genomdannelse 8. Sådanne modified ES-celler kan injiceres i museblastocyster at producere afkom (kimærer), som så kan overføre disse modificerede alleler via kimcellelinje 9. En alternativ vej til at producere transgene mus involverer mikroinjektion af en genekspressionsvektor i encellede mus zygoter, der fører til tilfældig integration af vektoren i musegenomet 10. Traditionelle metoder til vektor konstruktion har påberåbt sig konventionelle "klippe og klistre" kloning ved hjælp af restriktionsenzymer og DNA-ligaser at klone de forskellige valg markør og genomiske fragmenter i en vektor rygrad. Imidlertid en iboende begrænsende faktor af traditionel kloning er positioneringen og valget af restriktionssteder, især med længere DNA-sekvenser. Dette nødvendiggør ofte flere subkloningstrin og også indfører fremmede DNA-sekvenser i vektoren, hvilket ofte fører til en lavere effektivitet af gen-targeting.
Recombineering (rekombinogen engineering) er en DNA-teknik teknologi, der overvinder disse begrænsninger ved hjælp af homolog rekombination (HR) medieret ved fag rekombinationsproteiner i E. coli-celler 11,12. Eftersom enhver region af en homolog sekvens kan tjene som et substrat for recombineering er de begrænsninger, tilgængeligheden af restriktionssteder fjernet. Store DNA-sekvenser kan problemfrit ændres direkte in vivo, således også bevare deres strukturelle integritet 13. Recombineering er meget effektiv med korte homologier (50 bp) 14 og derfor homologiarme (HA) kan nemt inkorporeres i syntetiske oligo-sekvenser. I et typisk recombineering eksperiment, et oligo- eller et dobbeltstrenget DNA (dsDNA) fragment indeholdende HA elektroporeret ind recombineering kompetente E. coli-celler indeholdende målet placeret enten på kromosomet eller på et plasmid 15. Den rekombination potentiale tillægges ved inducerbar ekspression af den røde recombination proteiner af fagen 16,17 eller RecET proteiner af rac profag 18. The Red / RecE exonuclease konverterer lineære dsDNA til en enkeltstrenget DNA (ssDNA) mellemprodukt, som derefter bundet af sin partner, rød / RecT, en enkeltstrenget annealing protein (SSAP) 19. Indtræder annealing af en lang ssDNA eller en kort oligo til dens komplementære målsekvens på tilbagestående streng af replikationsgaflen og fører til inkorporering af sekvensen ved målstedet. Halter streng ssDNA rekombination er grundlaget for den høje effektivitet af recombineering og kan beskrives ved den "beta" rekombination model 20,21.
En typisk recombineering arbejdsgang at opbygge en målrettet gen vektor omfatter en af de to følgende ruter. En rute involverer subkloning den ønskede genomiske region fra en mus BAC klon i et plasmid efterfulgt af sekventiel insertion af LoxP rekombinationssteder, en selektionsmarkør <sop> 22 mm, eller den alternative rute involverer målretning BAC genomiske locus med de forskellige targeting vektor elementer af flere runder af recombineering 10,23 og derefter subkloning det modificerede locus i et plasmid med hul reparation kloning 24,25. Variationer over dette tema har været anvendt i forskellige high-throughput recombineering rørledninger som en del af store mus produktionsprogrammer 26,27. Disse procedurer involverer komplicerede og langvarige faser, kræver anvendelse af specialiserede vektorer og E. coli-stammer (f.eks Cre-udtrykkende celler) og udnytte en eller flere mellemliggende trin af vektor-DNA rensning og re-transformation (tabel 1). Subkloning plus insertion (SPI) er en hidtil ukendt recombineering teknik, der kombinerer beta rekombination og gap reparation kloning i en enkelt proces (figur 1). SPI vektor samling er enkel, hurtig og fleksibel og er en betydelig forbedring på standard recombiEngineering nærmer (tabel 1). Her viser vi den lethed og nytten af at bruge SPI til forskellige vektor byggeri applikationer med særlig vægt på at konstruere ikke-standard og udfordrende vektor design. Testcases omfattede konstruktionen af en fluorescerende reporter Knockin vektor, en dobbelt mærket proteinekspression Knockin vektor en BAC fluorescerende reporter vektor og en betinget knockout vektor. Disse undersøgt forskelligt kravet om at lokalisere en celleoverfladereceptor, rense en nuklear kompleks protein eller betinget ablatere ekspressionen af et gen.
Konstruktion af ES-cellelinier og musemodeller har historisk involveret genmålretning hjælp plasmidkonstruktioner der indeholdt den modificerede allel 4. Imidlertid har konstruktionen af disse komplekse genmålretning vektorer viste sig at være en betydelig flaskehals i rettidig produktion af sådanne modeller. Udviklingen af recombineering baseret vektor byggeri strategier har givet forbedrede vektor design og mere effektiv vektor samling. Ikke desto mindre aktuelle recombineering protokoller stadig involverer flere trin, kræver mellemliggende plasmid oprensning og bruge forskellige bakteriestammer. Subkloning plus insertion tilbyder en ny tilgang til vektorkonstruktion, der kan udføres i én elektroporation begivenhed i resident BAC værtsstammen. Anvendeligheden af SPI i targeting-genet blev testet her i en række vektorkonstruktion applikationer. I alle her undersøgte tilfælde SPI vist sig at være effektive, og det korrekte rekombinante plasmid blev fremstillet.I de fleste tilfælde blev flere forskellige kassetter isat korrekt i targeting vektor. Store DNA kassetter og vektorer blev let rummes i SPI protokollen og demonstreret fleksibiliteten i dette system.
SPI bygger på anvendelsen af lange homologi sekvenser og phosphorthioat (PTO) beskyttelse af det lineære DNA-kassetter. PTO modifikation giver beskyttelse mod exonukleaser til det lineære DNA 20,21 og den lange HA øger rekombination effektivitet at tillade multiplexing. Men syntese af længere oligo-sekvenser øger chancerne for at akkumulere fejl især sletninger. Mutationer i oligo kan være særlig skadeligt, hvis de omfatter proteinkodende regioner. DNA-sekventering over HA og dækker den fulde længde af den indsatte kassette anbefales at fjerne kloner med eventuelle sekvensændringer. Anvendelse af en high-fidelity DNA polymerase system er også foreslået at undgå indførelsen af eny PCR-fejl. Længden og sammensætningen af HA af subkloning plasmidet er mere kritisk i forhold til den af indsættelsen kassetten (data ikke vist). For særligt følsomme applikationer som konstruktion af Knockin vektorer, hvor eventuelle mutationer i exon regioner ikke tolereres, kan ha indsættelsen kassetten afkortes (50-120 bp) for at undgå problemer i forbindelse med lange oligoer. Indsættelsen kassette kan også stå umodificeret eller dual phosphorothioated (hvor viden om retningen af replikation er ikke tilgængelig). Men multiplexing i disse tilfælde stadig kræver lang beskyttet HA subkloning plasmider. En advarsel af denne strategi er en sænkning af multiplexing effektivitet, som potentielt kan påvirke SPI kloning på forskellige loci.
Længden af insertionen kassetten og subkloning plasmid er en anden vigtig parameter i SPI kloning. Større DNA-molekyler elektroporere mindre effektivt og effekten er kumulative, givet reminimum skal udgøre at indføre alle kassetterne i den samme celle (data ikke vist). Multiplexing er mest effektiv med mindre indsættelse kassetter. DNA-fragmenter større end 3 kb placere også en grænse for Red medieret ssDNA behandling, som er mest effektive til 3 kb 30. Indsætningspunkter kassetter end 3 kb er dobbelt resekterede og kombinere mindre effektivt via en beta uafhængig vej 20. Derfor screening af tilstrækkelige kolonier for at identificere den korrekte klon bliver vigtigt i disse tilfælde. En længere varighed af rekombination efter elektroporation også øger chancerne for inddrivelse af den korrekte klon i vanskelige SPI øvelser. Op til fire små kassetter (<1,5 kb) kan indsættes samtidigt med SPI-processen, selvom multiplexing effektivitet aftager med hver ekstra kassette (data ikke vist). Men det afspejler resultatet af en optimal SPI eksperiment, og det er tilrådeligt at overveje grænserne for multiplexing, når du bruger mange store kassetter. </p>
Udviklingen af genom redigeringsværktøjer som klynger regelmæssigt spatierede korte palindromiske gentagelser (CRISPR) -cas9 endonuklease systemet har gjort det muligt at skabe nye genom ændringer og har ført til en mere effektiv genom engineering 36. Imidlertid har disse nyere teknologier suppleret gen-targeting vektorer i stedet erstattet dem. Det forventes, at CRISPR-cas system kan erstatte antibiotika udvælgelse og yderligere at forfine multiplex recombineering protokollen.
The authors have nothing to disclose.
T.R.R conceived the project, designed and performed experiments and prepared the manuscript. E.J.K and S.E.M performed experiments. All authors contributed intellectually to the final manuscript. This work was funded by a University of Leicester Innovation Fellowship to SEM and by a UK Medical Research Council (MRC) Senior Research Fellowship to S.M.C (MR/J009202/1). DNA sequencing was performed by Protein and Nucleic Acid Laboratories (PNACL), Centre for Core Biotechnology Services, University of Leicester. We wish to thank A. Francis Stewart for providing the Rox and Dre plasmids. pL451 and pL452 plasmids were obtained from National Cancer Institute (NCI), Frederick, USA.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Antibiotics except Zeocin | Sigma: http://www.sigmaaldrich.com | Ampicillin, A9518-5G; Chloramphenicol , C1919-5G; Blasticidin, 15205-25MG; Gentamicin, G1264-50MG; Hygromycin, H3274-50MG; Kanamycin,: K1876-1G; Tetracycline hydrochloride, T7660-5G; Trimethoprim, 92131-1G |
|
Zeocin | Invivogen: | ant-zn-1 | Zeocin is also available from Life technologies/Fisher |
C57BL/6 BAC clones | CHORI: https://bacpac.chori.org/ | RPCI-23 or RPCI-24 BAC libraries | 129/Sv BAC clones can be obtained from Invivogen or Life technologies/Fisher |
KOD hotstart DNA polymerase system | Millipore: https://www.merckmillipore.com | 71086-3 | |
L-Arabinose | Sigma: http://www.sigmaaldrich.com | A3256-25G | |
Long oligos | IDT: https://www.idtdna.com; Gene link: https://www.genelink.com | IDT Ultramers or Gene Link long oligos | PTO and Phosphosphate available as custom modifications. PAGE purification strongly recommended for long oligos. |
MinElute PCR purification kit | Qiagen: http://www.qiagen.com | 28004 | Minimum elution PCR purifications kits are preferred. |
QIAPrep Spin Mini Prep kit | Qiagen: http://www.qiagen.com | 27104 | Silica column or similar matrix kits are preferred. |
Restriction enzymes | NEB: https://www.neb.com | DpnI: R0176L | See NEB website for a list of RE. |