Gene targeting methodologies can be used to generate transgenic mice with knockout, knock-in and tagged alleles. Here, we describe an improved method of recombineering in E. coli, that we term ‘subcloning plus insertion’, which can be used to generate custom gene targeting vectors rapidly.
Gene targeting refers to the precise modification of a genetic locus using homologous recombination. The generation of novel cell lines and transgenic mouse models using this method necessitates the construction of a ‘targeting’ vector, which contains homologous DNA sequences to the target gene, and has for many years been a limiting step in the process. Vector construction can be performed in vivo de Escherichia coli cells using homologous recombination mediated by phage recombinases using a technique termed recombineering. Recombineering is the preferred technique to subclone the long homology sequences (>4kb) and various targeting elements including selection markers that are required to mediate efficient allelic exchange between a targeting vector and its cognate genomic locus. Typical recombineering protocols follow an iterative scheme of step-wise integration of the targeting elements and require intermediate purification and transformation steps. Here, we present a novel recombineering methodology of vector assembly using a multiplex approach. Plasmid gap repair is performed by the simultaneous capture of genomic sequence from mouse Bacterial Artificial Chromosome libraries and the insertion of dual bacterial and mammalian selection markers. This subcloning plus insertion method is highly efficient and yields a majority of correct recombinants. We present data for the construction of different types of conditional gene knockout, or knock-in, vectors and BAC reporter vectors that have been constructed using this method. SPI vector construction greatly extends the repertoire of the recombineering toolbox and provides a simple, rapid and cost-effective method of constructing these highly complex vectors.
जीन को लक्षित प्रौद्योगिकियों के विकास के विभिन्न जैविक प्रणालियों 1-3 की जांच के लिए सेल लाइनों और माउस मॉडल के निर्माण के लिए सक्षम है। एक जीनोमिक अनुक्रम के संशोधन में एक महत्वपूर्ण पहला चरण वेक्टर 4 को लक्षित एक जीन का डिजाइन और निर्माण है। लक्ष्य निर्धारण वैक्टर एक चयन मार्कर (जैसे, neomycin) द्वारा flanked वांछित संशोधनों (एस) युक्त हित के एलील ले कि प्लाज्मिड निर्माणों, और स्तनधारी कोशिकाओं 5 में कुशल मुताबिक़ पुनर्संयोजन के लिए आवश्यक लंबे जीनोमिक क्षेत्रों के हैं। सटीक जीन संशोधन भ्रूण स्टेम में लक्षित कर वेक्टर की शुरूआत (ते) कोशिकाओं 6 या दैहिक कोशिकाओं 7, द्वारा हासिल की है जिससे लक्षित कर वेक्टर पर डीएनए अनुक्रम का समान हिस्सों के बीच मुताबिक़ पुनर्संयोजन और इच्छित संशोधन के हस्तांतरण में जीनोमिक ठिकाना परिणाम जीन रूपांतरण 8 से जीनोम के लिए। इस तरह के modifiएड ES कोशिकाओं तो germline 9 के माध्यम से इन संशोधित एलील हस्तांतरित कर सकते हैं कि वंश (chimaeras) का उत्पादन करने के लिए माउस blastocysts में इंजेक्ट किया जा सकता है। ट्रांसजेनिक चूहों का उत्पादन करने के लिए एक वैकल्पिक मार्ग माउस जीनोम 10 में वेक्टर के यादृच्छिक एकीकरण की ओर जाता है जो एक कोशिकीय माउस युग्मनजों में एक जीन की अभिव्यक्ति वेक्टर, के microinjection शामिल है। वेक्टर निर्माण के पारंपरिक तरीकों पारंपरिक पर भरोसा किया है एक वेक्टर रीढ़ की हड्डी में विभिन्न चयन मार्कर और जीनोमिक टुकड़े क्लोन करने के लिए प्रतिबंध एंजाइमों और डीएनए ligases का उपयोग कर क्लोनिंग 'कट और पेस्ट'। हालांकि, पारंपरिक क्लोनिंग का एक अंतर्निहित सीमित कारक स्थिति और प्रतिबंध साइटों के चुनाव को विशेष रूप से लंबे समय तक डीएनए दृश्यों के साथ है। यह अक्सर कई subcloning चरणों जरूरी है और यह भी अक्सर को लक्षित जीन की एक कम क्षमता की ओर जाता है जो वेक्टर, में बाहरी डीएनए दृश्यों का परिचय।
Recombineering (recombinogenic Engineering) ई में फेज पुनर्संयोजन प्रोटीन द्वारा मध्यस्थता मुताबिक़ पुनर्संयोजन (मानव संसाधन) का उपयोग करके इन सीमाओं पर काबू पा कि एक डीएनए इंजीनियरिंग प्रौद्योगिकी है कोलाई कोशिकाओं 11,12। एक मुताबिक़ अनुक्रम के किसी भी क्षेत्र recombineering का एक सब्सट्रेट के रूप में काम कर सकते हैं, प्रतिबंध साइटों की उपलब्धता की कमी को हटा रहे हैं। बड़े डीएनए दृश्यों को मूल इस प्रकार भी उनके संरचनात्मक अखंडता 13 के संरक्षण, विवो में सीधे रूप से संशोधित किया जा सकता है। Recombineering कम homologies (50 बीपी) 14 और इसलिए अनुरूपता हथियार (हेक्टेयर) आसानी से सिंथेटिक oligo दृश्यों में शामिल किया जा सकता है के साथ बहुत ही कुशल है। एक ठेठ recombineering प्रयोग, एक oligo या हा युक्त एक डबल असहाय डीएनए (dsDNA) टुकड़ा में recombineering सक्षम ई में electroporated है गुणसूत्र पर या एक प्लाज्मिड 15 पर या तो स्थित लक्ष्य युक्त कोलाई कोशिकाओं। पुनर्संयोजन संभावित लाल आरईसी की inducible अभिव्यक्ति द्वारा प्रदत्त हैombination फेज 16,17 के प्रोटीन या आरएसी prophage 18 की RecET प्रोटीन। लाल / rece exonuclease तो इसकी सहयोगी, लाल / रंगरूट, एक एकल असहाय annealing के प्रोटीन (SSAP) 19 से बाध्य है जो मध्यवर्ती एक एकल असहाय डीएनए (ssDNA), रैखिक dsDNA धर्मान्तरित। एक लंबे ssDNA या उसके पूरक लक्ष्य अनुक्रम के लिए एक छोटी oligo के annealing के प्रतिकृति कांटा की ठंड कतरा पर होता है और लक्ष्य साइट पर अनुक्रम का समावेश होता है। कतरा ssDNA पुनर्संयोजन ठंड recombineering की उच्च क्षमता का आधार है और 'बीटा' पुनर्संयोजन मॉडल 20,21 द्वारा वर्णित किया जा सकता है।
एक ठेठ recombineering कार्यप्रवाह एक जीन को लक्षित वेक्टर दो निम्नलिखित मार्गों के दोनों शामिल है का निर्माण करने के लिए। एक मार्ग LoxP पुनर्संयोजन साइटों की अनुक्रमिक प्रविष्टि, एक चयन मार्कर द्वारा पीछा एक प्लाज्मिड में एक माउस बीएसी क्लोन से वांछित जीनोमिक क्षेत्र subcloning शामिल <sऊपर> 22 आदि, या वैकल्पिक मार्ग 10,23 recombineering और फिर 24,25 क्लोनिंग की खाई को मरम्मत के द्वारा एक प्लाज्मिड में संशोधित ठिकाना subcloning के कई दौर से अलग लक्ष्यीकरण वेक्टर तत्वों के साथ बीएसी जीनोमिक ठिकाना को लक्षित करना शामिल है। इस विषय पर रूपांतरों बड़ी माउस उत्पादन कार्यक्रमों 26,27 के हिस्से के रूप में विभिन्न उच्च throughput recombineering पाइपलाइनों में इस्तेमाल किया गया है। हालांकि, इन प्रक्रियाओं, जटिल और लंबा चरणों को शामिल विशेष वैक्टर और ई के उपयोग की आवश्यकता कोलाई उपभेदों के लिए (जैसे, रचनात्मक व्यक्त कोशिकाओं) और वेक्टर डीएनए शुद्धि और फिर से परिवर्तन (1 टेबल) के एक या एक से अधिक मध्यवर्ती चरणों का उपयोग। प्लस प्रविष्टि (एसपीआई) subcloning बीटा पुनर्संयोजन और एक ही प्रक्रिया में क्लोनिंग की खाई मरम्मत (चित्रा 1) को जोड़ती है एक उपन्यास recombineering तकनीक है। एसपीआई वेक्टर विधानसभा सरल, जल्दी और लचीला और मानक recombi पर महत्वपूर्ण सुधार प्रदान करता हैneering (तालिका 1) दृष्टिकोण। यहाँ, हम आसानी और गैर मानक और चुनौतीपूर्ण वेक्टर डिजाइन के निर्माण पर एक विशेष जोर देने के साथ विभिन्न वेक्टर निर्माण अनुप्रयोगों के लिए SPI का उपयोग करने का उपयोगिता प्रदर्शित करता है। परीक्षण के मामलों में एक फ्लोरोसेंट रिपोर्टर Knockin वेक्टर का निर्माण, एक दोहरी टैग प्रोटीन अभिव्यक्ति Knockin वेक्टर, एक बीएसी फ्लोरोसेंट संवाददाता वेक्टर और एक सशर्त पीटकर वेक्टर शामिल थे। ये विभिन्न एक परमाणु प्रोटीन जटिल, एक कोशिका की सतह रिसेप्टर स्थानीयकरण शुद्ध करने के लिए आवश्यकता की जांच या सशर्त एक जीन की अभिव्यक्ति काटकर अलग करना।
ES सेल लाइनों और माउस मॉडल का निर्माण ऐतिहासिक संशोधित एलील 4 निहित है कि प्लाज्मिड निर्माणों का उपयोग कर को लक्षित जीन शामिल किया गया है। हालांकि, इन जटिल जीन को लक्षित वैक्टर का निर्माण इस तरह के मॉडल का समय पर उत्पादन में एक महत्वपूर्ण अड़चन साबित हुई है। recombineering आधारित वेक्टर निर्माण रणनीतियों के विकास में सुधार वेक्टर डिजाइन और अधिक कुशल वेक्टर विधानसभा अनुमति दी गई है। बहरहाल, वर्तमान recombineering प्रोटोकॉल अभी भी कई कदम शामिल मध्यवर्ती प्लाज्मिड शोधन की आवश्यकता होती है और विभिन्न जीवाणु उपभेदों का उपयोग करें। प्लस प्रविष्टि subcloning निवासी बीएसी मेजबान तनाव में एक इलेक्ट्रोपोरेशन घटना में प्रदर्शन किया जा सकता है कि वेक्टर निर्माण करने के लिए एक उपन्यास दृष्टिकोण प्रदान करता है। जीन लक्ष्यीकरण में SPI की उपयोगिता वेक्टर निर्माण आवेदनों की एक किस्म में यहाँ परीक्षण किया गया था। यहां जांच की सभी उदाहरणों में, SPI कुशल साबित हुई और सही पुनः संयोजक प्लाज्मिड उत्पादन किया गया था।अधिकांश मामलों में, कई विभिन्न कैसेट सही ढंग से लक्षित कर सदिश में डाला गया था। बड़े डीएनए कैसेट और वैक्टर आसानी से SPI प्रोटोकॉल में शामिल किया है और इस प्रणाली के लचीलेपन का प्रदर्शन किया गया।
एसपीआई लंबे अनुरूपता दृश्यों और रैखिक डीएनए कैसेट की phosphorothioate (PTO) संरक्षण के उपयोग पर निर्भर करता है। PTO संशोधन रैखिक डीएनए 20,21 को exonucleases के खिलाफ संरक्षण प्रदान करने और लंबे समय हा बहुसंकेतन की अनुमति के लिए पुनर्संयोजन क्षमता बढ़ जाती है। हालांकि, अब oligo दृश्यों के संश्लेषण त्रुटियों विशेष रूप से हटाए गए जमते की संभावना बढ़ जाती है। वे प्रोटीन कोडिंग क्षेत्रों को कवर अगर oligo में उत्परिवर्तन विशेष रूप से हानिकारक हो सकता है। डीएनए हा भर अनुक्रमण और डाला कैसेट की पूरी लंबाई को कवर अत्यधिक किसी भी क्रम परिवर्तन के साथ क्लोन को खत्म करने की सिफारिश की है। एक उच्च निष्ठा डीएनए पोलीमरेज़ प्रणाली का उपयोग भी एक की शुरूआत से बचने के लिए सुझाव दिया हैY पीसीआर त्रुटियों। subcloning प्लाज्मिड हा की लंबाई और संरचना प्रविष्टि कैसेट के सापेक्ष अधिक महत्वपूर्ण है (डेटा) नहीं दिखाया। एक्सॉन क्षेत्रों में किसी भी म्यूटेशन सहन नहीं कर रहे हैं, जहां Knockin वैक्टर, के निर्माण की तरह विशेष रूप से संवेदनशील अनुप्रयोगों के लिए, सम्मिलन कैसेट की हा लंबी oligos से जुड़ी समस्याओं से बचने के लिए (50-120 बीपी) को छोटा किया जा सकता है। सम्मिलन कैसेट भी (प्रतिकृति की दिशा का ज्ञान उपलब्ध नहीं है) असंशोधित या दोहरी phosphorothioated छोड़ा जा सकता है। लेकिन इन मामलों में बहुसंकेतन अभी भी लंबी हा subcloning प्लास्मिड संरक्षित करने की आवश्यकता है। इस विशेष रणनीति का एक चेतावनी है कि संभावित अलग loci में एसपीआई क्लोनिंग को प्रभावित कर सकता है कि बहुसंकेतन दक्षता के कम है।
सम्मिलन कैसेट और subcloning प्लाज्मिड की लंबाई एसपीआई क्लोनिंग में एक और महत्वपूर्ण पैरामीटर है। बड़ा डीएनए अणु कम कुशलता electroporate और प्रभाव फिर से दिया, संचयी हैएक ही सेल में सभी कैसेट पेश करने का quirement (डेटा) नहीं दिखाया। बहुसंकेतन छोटे सम्मिलन कैसेट के साथ सबसे कारगर है। डीएनए से बड़ा 3 केबी भी 3 केबी 30 अप करने के लिए सबसे कारगर है जो लाल मध्यस्थता ssDNA प्रसंस्करण पर एक सीमा होती है, जगह टुकड़े। 3 KB से अधिक निवेशन कैसेट resected दोहरा रहे हैं और एक बीटा स्वतंत्र मार्ग 20 के माध्यम से कम कुशलता recombine। इसलिए, सही क्लोन की पहचान करने के लिए पर्याप्त कालोनियों की स्क्रीनिंग के इन मामलों में महत्वपूर्ण हो जाता है। पुनर्संयोजन पोस्ट electroporation की एक लंबी अवधि के लिए भी मुश्किल एसपीआई अभ्यास में सही क्लोन की वसूली की संभावना बढ़ जाती है। चार छोटे कैसेट (<1.5 KB) बहुसंकेतन दक्षता प्रत्येक अतिरिक्त कैसेट के साथ कम हो जाती है, हालांकि एसपीआई प्रक्रिया के साथ एक साथ डाला जा सकता है अप करने के लिए (डेटा) नहीं दिखाया। बहरहाल, यह एक इष्टतम एसपीआई प्रयोग के परिणाम को दर्शाता है और यह कई बड़े कैसेट का उपयोग करते समय बहुसंकेतन की सीमा पर विचार करने की सलाह दी जाती है। </p>
क्लस्टर नियमित रूप से interspaced कम मुरजबंध संबंधी दोहराता तरह जीनोम संपादन उपकरण का विकास (CRISPR) -cas9 endonuclease प्रणाली उपन्यास जीनोम संशोधनों के निर्माण के लिए सक्षम है और अधिक कुशल जीनोम इंजीनियरिंग 36 के लिए प्रेरित किया। हालांकि, इन नई प्रौद्योगिकियों जीन को लक्षित वैक्टर पूरित बजाय उन्हें supplanted है। यह CRISPR कैस प्रणाली एंटीबायोटिक चयन की जगह है और आगे मल्टीप्लेक्स recombineering प्रोटोकॉल को परिष्कृत कर सकता है कि परिकल्पना की गई है।
The authors have nothing to disclose.
T.R.R conceived the project, designed and performed experiments and prepared the manuscript. E.J.K and S.E.M performed experiments. All authors contributed intellectually to the final manuscript. This work was funded by a University of Leicester Innovation Fellowship to SEM and by a UK Medical Research Council (MRC) Senior Research Fellowship to S.M.C (MR/J009202/1). DNA sequencing was performed by Protein and Nucleic Acid Laboratories (PNACL), Centre for Core Biotechnology Services, University of Leicester. We wish to thank A. Francis Stewart for providing the Rox and Dre plasmids. pL451 and pL452 plasmids were obtained from National Cancer Institute (NCI), Frederick, USA.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Antibiotics except Zeocin | Sigma: http://www.sigmaaldrich.com | Ampicillin, A9518-5G; Chloramphenicol , C1919-5G; Blasticidin, 15205-25MG; Gentamicin, G1264-50MG; Hygromycin, H3274-50MG; Kanamycin,: K1876-1G; Tetracycline hydrochloride, T7660-5G; Trimethoprim, 92131-1G |
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Zeocin | Invivogen: | ant-zn-1 | Zeocin is also available from Life technologies/Fisher |
C57BL/6 BAC clones | CHORI: https://bacpac.chori.org/ | RPCI-23 or RPCI-24 BAC libraries | 129/Sv BAC clones can be obtained from Invivogen or Life technologies/Fisher |
KOD hotstart DNA polymerase system | Millipore: https://www.merckmillipore.com | 71086-3 | |
L-Arabinose | Sigma: http://www.sigmaaldrich.com | A3256-25G | |
Long oligos | IDT: https://www.idtdna.com; Gene link: https://www.genelink.com | IDT Ultramers or Gene Link long oligos | PTO and Phosphosphate available as custom modifications. PAGE purification strongly recommended for long oligos. |
MinElute PCR purification kit | Qiagen: http://www.qiagen.com | 28004 | Minimum elution PCR purifications kits are preferred. |
QIAPrep Spin Mini Prep kit | Qiagen: http://www.qiagen.com | 27104 | Silica column or similar matrix kits are preferred. |
Restriction enzymes | NEB: https://www.neb.com | DpnI: R0176L | See NEB website for a list of RE. |