Gene targeting methodologies can be used to generate transgenic mice with knockout, knock-in and tagged alleles. Here, we describe an improved method of recombineering in E. coli, that we term ‘subcloning plus insertion’, which can be used to generate custom gene targeting vectors rapidly.
Gene targeting refers to the precise modification of a genetic locus using homologous recombination. The generation of novel cell lines and transgenic mouse models using this method necessitates the construction of a ‘targeting’ vector, which contains homologous DNA sequences to the target gene, and has for many years been a limiting step in the process. Vector construction can be performed in vivo de Escherichia coli cells using homologous recombination mediated by phage recombinases using a technique termed recombineering. Recombineering is the preferred technique to subclone the long homology sequences (>4kb) and various targeting elements including selection markers that are required to mediate efficient allelic exchange between a targeting vector and its cognate genomic locus. Typical recombineering protocols follow an iterative scheme of step-wise integration of the targeting elements and require intermediate purification and transformation steps. Here, we present a novel recombineering methodology of vector assembly using a multiplex approach. Plasmid gap repair is performed by the simultaneous capture of genomic sequence from mouse Bacterial Artificial Chromosome libraries and the insertion of dual bacterial and mammalian selection markers. This subcloning plus insertion method is highly efficient and yields a majority of correct recombinants. We present data for the construction of different types of conditional gene knockout, or knock-in, vectors and BAC reporter vectors that have been constructed using this method. SPI vector construction greatly extends the repertoire of the recombineering toolbox and provides a simple, rapid and cost-effective method of constructing these highly complex vectors.
Gen hedefleme teknolojilerin geliştirilmesi, farklı biyolojik sistemlerin 1-3 araştırmak için hücre hatları ve fare modellerinin yapımını sağladı. Genomik dizisinin değişimiyle anahtar ilk aşama 4 vektörü hedef gen tasarım ve yapı. Hedefleme vektörler, bir seçim işaretleyici (örn, neomisin) tarafından kapatılması istenen bir değişiklik (ler) i ihtiva eden ilgi aleli taşıyan plazmit ve memeli hücrelerinde 5 verimli homolog rekombinasyon için gerekli olan uzun genomik bölgelerdir. Hassas gen modifikasyonu embriyonik kök hedefleme Vektörün sokulmasıyla (ES) hücreleri üretilmiş 6 ya da somatik hücreler 7 ile elde edilir ve böylece hedef vektör DNA dizisinin aynı uzanan arasında homolog rekombinasyon ve amaçlanan modifikasyon transferinde genomik lokus sonuçları Gen dönüşümü 8 ile genomuna. Bu modifiEd ES hücreleri daha sonra germlin 9 vasıtasıyla modifiye edilmiş bu allel iletebilir yavrular (Khimaira'da) üretilmesi için fare blastokistlerine enjekte edilebilir. Transjenik farelerin üretilmesi için alternatif bir yol, fare genomu 10 vektörün rastlantısal bir bütünleşmesine yol açan tek hücreli fare zigot bir gen ifade vektörü, mikroenjeksiyon içerir. Vektör inşaat Geleneksel yöntemler konvansiyonel yararlanmıştır bir vektör omurgasına farklı seçim işaretleyici ve genomik fragmanları klonlamak için sınırlama enzimleri ve DNA ligaz kullanılarak klonlama 'kes ve yapıştır'. Ancak, geleneksel klonlama içsel bir sınırlayıcı faktör konumlandırma ve sınırlama sitelerinin seçimi özellikle uzun DNA dizileri ile vardır. Bu genellikle birden fazla alt klonlama adımları gerektirir ve aynı zamanda sık sık hedef geninin daha düşük bir etkinliğe yol vektörü içine yabancı DNA dizilerini sunmaktadır.
Recombineering (rekombinojenik engineering) E. faj rekombinasyon proteinleri aracılığı ile homolog rekombinasyon (HR) kullanarak bu kısıtlamaların üstesinden bir DNA mühendisliği teknolojisi E. coli hücreleri, 11,12. Homolog bir dizinin herhangi bir bölge recombineering bir alt-tabaka olarak hizmet için, restriksiyon siteleri mevcudiyetine kısıtlamaları kaldırılır. Büyük DNA dizileri sorunsuz dolayısıyla yapısal bütünlüğünü 13 koruyarak, doğrudan in vivo modifiye edilebilir. Recombineering kısa bir homoloji (50 bp), 14 ve bu nedenle homoloji kolları (HA), uygun sentetik oligo dizileri dahil edilebilir çok etkilidir. Tipik Recombineering deney, bir oligo veya bir HA ihtiva eden bir çift şeritli DNA (dsDNA) fragmanı olarak Recombineering yetkili E. elektropore edildi kromozom üzerinde veya bir plazmid 15 ya yer alan hedef içeren coli hücreleri. rekombinasyon potansiyeli Kırmızı rec indüklenebilir ifade tarafından verilmektedirombination faj 16,17 proteinler veya rac profajından 18 RecET proteinleri. Kırmızı / rece eksonükleaz sonra ortağı, Kırmızı / Rect, tek damarlı bir tavlama protein (SSAP) 19 ile bağlı olan ara ürün olarak tek kordonlu bir DNA (ssDNA), lineer dsDNA dönüştürür. Uzun bir ssDNA ya da tamamlayıcı bir hedef sekansın kısa bir oligo tavlama replikasyon çatal gecikmeli şeridi üzerinde meydana gelir ve hedef bölgede dizisinin dahil edilmesine yol açar. Strand ssDNA rekombinasyon kalmış recombineering yüksek verimlilik temeli olan ve 'beta' rekombinasyon modeli 20,21 ile tarif edilebilir.
Tipik bir Recombineering iş akışı bir gen hedefleme vektör aşağıdaki iki yolların birini içerir inşa etmek. Bir yol LoxP rekombinasyon siteleri sıralı ekleme, bir işaretleyici tarafından izlenen bir plasmid içine bir fare BAC klon istenen genomik bölge alt klonlama içerir <syukarı> 22 vb veya alternatif rota 10,23 Recombineering ve daha sonra 24,25 klonlama boşluk tamir bir plazmid içine modifiye odağı alt klonlama birden fazla mermi farklı hedefleme vektör elemanları ile BAC genomik odağı hedef içerir. Bu tema üzerine varyasyonlar büyük fare üretim programlarının 26,27 parçası olarak farklı yüksek verimli Recombineering boru hatlarında kullanılmaktadır. Ancak, bu işlemler, karmaşık ve uzun aşamaları içeren özel vektörler ve E. kullanılmasını gerektirir E. coli suşları (örneğin, Cre hücrelerini tanımlayan) ve vektör DNA, saflaştırma ve yeniden dönüştürme (Tablo 1), bir ya da daha fazla ara adımlar kullanmaktadır. Artı sokulmasını (SPI) alt-klonlanması p rekombinasyona ve tek bir işlem klonlama boşluk onarım (Şekil 1) bir araya getiren bir yeni Recombineering tekniğidir. SPI vektör montaj, basit, hızlı ve esnek ve standart Biraraya getiren önemli bir gelişme sunuyorve Mühendisliği (Tablo 1) yaklaşır. Burada, biz kolaylığı ve standart dışı ve zorlu vektör tasarımları inşa özel bir vurgu ile farklı vektör inşaat uygulamaları için SPI kullanarak programı göstermektedir. Test durumlarda floresan muhabiri çaldığımı vektör inşaat, çift etiketli bir protein ifadesi çaldığımı vektör, bir BAC floresan muhabiri vektör ve bir koşullu nakavt vektörü dahil. Bu çeşitli nükleer protein kompleksi, bir hücre yüzey reseptörü lokalize saflaştırmak için gereksinimi muayene veya koşullu gen ekspresyonunu baskılamak.
ES hücre hatları ve fare modellerinin yapımı tarihsel değiştirilmiş alel 4 içerdiği plazmid yapıları kullanarak hedef geni dahil etmiştir. Bununla birlikte, bu karmaşık gen hedefleme vektörlerinin yapılışı bu modellerin zamanında üretiminde önemli bir engel olduğu kanıtlanmıştır. Recombineering tabanlı vektör inşaat stratejilerinin geliştirilmesi gelişmiş vektör tasarımları ve daha verimli vektör düzeneğini sağladı. Bununla birlikte, mevcut Recombineering protokolleri hala çok adımları içerir ara plazmid saflaştırmayı gerektirir ve farklı bakteriyel soyları kullanılır. Artı sokulmasını alt-klonlanması yerleşik BAC konakçı suşu bir elektroporasyon durumunda gerçekleştirilebilir vektör yapımı için yeni bir yaklaşım sağlar. Gen hedefleme SPI yarar vektör inşaat çeşitli uygulamalar burada test edilmiştir. Burada incelenen tüm durumlarda, SPI etkili olduğu ve doğru rekombinant plazmidi üretilmiştir.Olguların çoğunluğunda, çok sayıda farklı kasetleri doğru hedefleme vektörüne sokulmuştur. Büyük DNA kasetleri ve vektörleri kolayca SPI protokolü ağırladı ve bu sistemin esnekliği saptandı.
SPI uzun homoloji dizileri ve lineer DNA kasetlerinin fosforotioat (PTO) koruma kullanımına dayanır. PTO değişiklik lineer DNA 20,21 ile egzonükleazlardan karşı koruma sağladığını ve uzun HA çoğullamayı izin rekombinasyon verimliliğini artırır. Ancak, uzun oligo dizilerinin sentezi hataları özellikle silmeler biriken şansını artırır. Ancak, protein kodlama bölgelerini kapsar halinde oligo mutasyonlar, özellikle zararlı olabilir. DNA, HA boyunca sıralama ve eklenen kasetin tam uzunlukta kapsayan yüksek bir sekansı değiştirmelerine sahip klonların elimine edilmesi tavsiye edilir. Yüksek doğrulukta bir DNA polimerazı sisteminin kullanılması da oluşumundan önerilmektediry PCR hataları. alt-klonlama plazmid HA uzunluğu bileşimi ekleme kasetinin bu göre daha kritiktir (veriler gösterilmemiştir). Ekson bölgesinde bir mutasyon tolere edilmez knock vektörleri yapımı gibi özellikle hassas uygulamaları için, ekleme kasetinin HA uzun oligo ile ilgili problemleri önlemek için (50-120 bp), kısaltılabilir. Ekleme kaset de (replikasyon yönünde bilgi mevcut değildir) değiştirilmemiş veya çift phosphorothioated bırakılabilir. Ancak bu durumda çoklayıcı hala uzun HA alt klonlama plasmidlerini korumalı gerektirir. Bu özel stratejinin bir uyarı potansiyel farklı noktalarda SPI klonlama etkileyebilir çoğullama verimlilik düşürücü olduğunu.
Ekleme kaseti ve alt klonlama plazmid uzunluğu SPI klonlama başka önemli parametredir. Büyük DNA molekülleri daha az verimli electroporate ve efekt yeniden verilen, birikimliaynı hücrede her kasetleri tanıtmak için gereksinimi (veriler gösterilmemiştir). Çoğullama küçük ekleme kasetleri ile en verimli. DNA, daha büyük 3 kb de 3 kb 30 kadar en verimli Kırmızı aracılı ssDNA işleme bir sınır, yer parçalanır. 3 kb aşan Yerleştirme kasetleri rezeke ikili ve beta bağımsız yolunun 20 üzerinden az verimli recombine. Bu nedenle, doğru klon tanımlamak için yeterli kolonilerin taranmasının, bu durumlarda önemli hale gelmektedir. Rekombinasyon sonrası elektroporasyon daha uzun bir süre de zor SPI egzersizleri doğru klon kurtarma şansını artırır. Dört küçük kasetler (<1.5 kb), çoklayıcı etkinliği her bir ek kaseti ile azalır olsa da, SPI işlemi ile eş zamanlı olarak eklenebilir kadar (veriler gösterilmemiştir). Ancak, bu optimal SPI deney sonucunu yansıtmaktadır ve birçok büyük kasetleri kullanırken çoğullama sınırlarını dikkate önerilir. </p>
kümelenmiş düzenli interspaced kısa yineleyen tekrarlar gibi genom düzenleme araçları geliştirilmesi (CRISPR) -cas9 endonükleaz sistemi yeni genom değişikliklerinin oluşturulmasını sağladı ve daha verimli genom mühendisliği 36 yol açmıştır. Ancak, bu yeni teknolojiler gen hedefleme vektörleri tamamlanmaktadır yerine onları supplanted var. Bu CRISPR-cas sistemi antibiyotik seçimi yerini ve daha multipleks Recombineering protokolü rafine ki öngörülmektedir.
The authors have nothing to disclose.
T.R.R conceived the project, designed and performed experiments and prepared the manuscript. E.J.K and S.E.M performed experiments. All authors contributed intellectually to the final manuscript. This work was funded by a University of Leicester Innovation Fellowship to SEM and by a UK Medical Research Council (MRC) Senior Research Fellowship to S.M.C (MR/J009202/1). DNA sequencing was performed by Protein and Nucleic Acid Laboratories (PNACL), Centre for Core Biotechnology Services, University of Leicester. We wish to thank A. Francis Stewart for providing the Rox and Dre plasmids. pL451 and pL452 plasmids were obtained from National Cancer Institute (NCI), Frederick, USA.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Antibiotics except Zeocin | Sigma: http://www.sigmaaldrich.com | Ampicillin, A9518-5G; Chloramphenicol , C1919-5G; Blasticidin, 15205-25MG; Gentamicin, G1264-50MG; Hygromycin, H3274-50MG; Kanamycin,: K1876-1G; Tetracycline hydrochloride, T7660-5G; Trimethoprim, 92131-1G |
|
Zeocin | Invivogen: | ant-zn-1 | Zeocin is also available from Life technologies/Fisher |
C57BL/6 BAC clones | CHORI: https://bacpac.chori.org/ | RPCI-23 or RPCI-24 BAC libraries | 129/Sv BAC clones can be obtained from Invivogen or Life technologies/Fisher |
KOD hotstart DNA polymerase system | Millipore: https://www.merckmillipore.com | 71086-3 | |
L-Arabinose | Sigma: http://www.sigmaaldrich.com | A3256-25G | |
Long oligos | IDT: https://www.idtdna.com; Gene link: https://www.genelink.com | IDT Ultramers or Gene Link long oligos | PTO and Phosphosphate available as custom modifications. PAGE purification strongly recommended for long oligos. |
MinElute PCR purification kit | Qiagen: http://www.qiagen.com | 28004 | Minimum elution PCR purifications kits are preferred. |
QIAPrep Spin Mini Prep kit | Qiagen: http://www.qiagen.com | 27104 | Silica column or similar matrix kits are preferred. |
Restriction enzymes | NEB: https://www.neb.com | DpnI: R0176L | See NEB website for a list of RE. |