نموذج الزرد ممكن من مرض الكلى المتعدد الكيسات: ضربة قاضية لل<em> wnt5a</em> أسباب الخراجات في الكلى اسماك الزرد
Summary
We describe a method of generating a possible zebrafish model of polycystic kidney disease. We used Tg(wt1b:GFP) fish to visualize kidney structure. Knockdown of wnt5a was by morpholino injection. Pronephric cyst formation after wnt5a knockdown was observed in this GFP transgenic zebrafish.
Abstract
Polycystic kidney disease (PKD) is one of the most common causes of end-stage kidney disease, a devastating disease for which there is no cure. The molecular mechanisms leading to cyst formation in PKD remain somewhat unclear, but many genes are thought to be involved. Wnt5a is a non-canonical glycoprotein that regulates a wide range of developmental processes. Wnt5a works through the planar cell polarity (PCP) pathway that regulates oriented cell division during renal tubular cell elongation. Defects of the PCP pathway have been found to cause kidney cyst formation. Our paper describes a method for developing a zebrafish cystic kidney disease model by knockdown of the wnt5a gene with wnt5a antisense morpholino (MO) oligonucleotides. Tg(wt1b:GFP) transgenic zebrafish were used to visualize kidney structure and kidney cysts following wnt5a knockdown. Two distinct antisense MOs (AUG – and splice-site) were used and both resulted in curly tail down phenotype and cyst formation after wnt5a knockdown. Injection of mouse Wnt5a mRNA, resistant to the MOs due to a difference in primary base pair structure, rescued the abnormal phenotype, demonstrating that the phenotype was not due to “off-target” effects of the morpholino. This work supports the validity of using a zebrafish model to study wnt5a function in the kidney.
Introduction
وقد استخدمت على نطاق واسع الزرد (دانيو rerio) الأجنة كنموذج لدراسة تطوير الكلى ومرض الكلى المتعدد الكيسات. وهناك العديد من المزايا لاستخدام الزرد كنموذج للحيوانات: جدوى دراسة التفاعلات الوراثية، والقدرة على استخدام العقاقير morpholinos (MO) للبروتين ضربة قاضية، وفرصة لفحص بسرعة أعداد كبيرة من الأجنة، وسهولة عرض الظواهر الجهاز في اليرقات 1 الحية. وسليفة الكلوة هي الكلى الأول لتطوير في الفقاريات وهي وظيفية في الزرد اليرقات 2. هيكل سليفة الكلوة الزرد مقارنة بسيطة نسبيا إلى الكلوة التالية الثدييات، والكلى الثالث والأخير لتطوير في الثدييات. نفرون هو وحدة عمل الكلى، مع كل الكلى البشرية تحتوي على ما بين 500،000-1،000،000 النيفرون 3،4 وكل الكلى الماوس وجود ما يقرب من 13،000 النيفرون 5، مما يجعل من الصعب مراقبة هيكل كليون واحد طن كلى الانسان أو الماوس. الزرد اثنين فقط النيفرون، ولكل كليون الزرد يحتوي على كافة المكونات الرئيسية وجدت في الكبيبة والأنابيب من الفئران والبشر 6 وأنواع الخلايا الكلوية المتخصصة مماثلة. بالمقارنة مع النماذج الفقاريات الأخرى مثل الضفدع، وكليون الزرد أكثر شبها نفرون الثدييات لأنه يحتوي على نظام مغلق 7.
في السنوات الأخيرة، تم التسلسل الجينوم الزرد، والسماح للمقدمة واسعة من الأدوات الوراثية، والموارد متحولة واسعة، ومجموعات من خطوط مراسل المعدلة وراثيا في نماذج الزرد. أشكال سليفة الكلوة الزرد بين 12-72 ساعة بعد الإخصاب (HPF) ويمكن تصور بسهولة في الأجنة شفافة. بروتين ورم في WILM في WT1 هو عامل أساسي للتنمية الكلى. خطوط الزرد المعدلة وراثيا التعبير عن بروتين الفلورية الخضراء (GFP) تحت سيطرة المروج wt1b تيراغرام (wt1b: GFP) تظهر GFP expression تقع تحديدا في المناطق سليفة الكلوة في الأجنة الزرد، بدءا من 17 HPF 8. سحاف الكلية (NPHP)، جسمية متنحية أمراض الكلى الكيسي، والتي تسببها طفرات الجينات NPHP 9. NPHP4 ضربة قاضية من قبل morpholino تسبب تشكيل الكيس في تيراغرام (wt1b: GFP). الأسماك 10 لذلك، هذا السمك المعدلة وراثيا هو نموذج مناسب لمراقبة الهياكل الكلى وتشكيل الكيس أثناء التطور الكلى. الأهم من ذلك، تأثير جهري التنمية الكلى يمكن دراستها باستخدام هذه السلالة في وقت وبكفاءة العمل.
وتصف ورقتنا استخدام تيراغرام (wt1b: GFP) الأسماك كنموذج لتصور تشكيل الكيس الكلى بعد تعديل الجينات. كنا البدء ولصق الموقع مكافحة الشعور المنظمات الأعضاء لاسقاط الجين wnt5a في الزرد. Wnt5a هو بروتين سكري يفرز غير متعارف عليه من عائلة WNT التي تلعب دورا هاما في تطوير مختلف الأجهزة وبعد الولادة الخلويةوظيفة 11. Wnt5a يعمل من خلال مسارات WNT غير متعارف عليها، بما في ذلك قطبية خلية مستو (PCP) المسار، الذي تم العثور على لعب دور في انقسام الخلايا الموجهة خلال استطالة الأنبوبية الكلوية. Wnt5a ينظم WNT / PCP المسار من خلال تشكيل مجمع مع مستقبلات التيروزين كيناز مثل (ريك)، والتي transduces مزيد Wnt5a الإشارات من خلال تشكيل مجمع مع VANGL البروتين قطبية خلية مستو 2 (Vangl2)، وبالتالي تعزيز الاستقرار Vangl2 12. عيوب في مسار PCP يمكن أن يؤدي إلى انقسام الخلايا بشكل عشوائي وتسبب تشكيل الكيس الكلوي. استخدمنا تيراغرام (wt1b: GFP) خط الزرد لمراقبة تشكيل الكيس الكلى التالية wnt5a ضربة قاضية. تيراغرام (wt1b: GFP) نموذج الزرد يسمح التصوير الحي والمراقبة في الوقت المناسب من هيكل الكلى. بعد wnt5a ضربة قاضية، تم العثور على تشكيل الكيس الكلى ابتداء من الساعة 24 HPF. في 72 HPF، الخراجات يمكن العثور عليها في الكبيبات والأنابيب القريبة. ويمكن أيضا أن هذه الطريقة يمكن استخدامها إلى screen الجينات الأخرى التي قد تتسبب في تشكيل الكيس الكلى.
Protocol
Representative Results
Discussion
مرض الكلى المتعدد الكيسات (PKD) هي واحدة من الأسباب الرئيسية للنهاية مرحلة المرض الكلوي في البشر ويتميز تشكيل التدريجي الكيس، وتضخم الكلى، والتنمية أنبوب صغير غير طبيعية 14. راثي PKD السائد (ADPKD) هو مرض وراثي الذي تحور إما PKD1، ترميز polycystin-1 (PC1)، أو PKD2، ترميز polycystin-2 (PC2)…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة (DK093625 لLH، وDK069909 وDK047757 إلى JHL) وVA (جائزة الاستحقاق I01BX000820 إلى JHL). ونود أن نشكر الدكتور مايكل حزمة والدكتور جي وفي جامعة ولاية بنسلفانيا اسماك الزرد الأساسية لتوفير الدعم الضروري.
Materials
| 0.5% Phenol-Red | Sigma | P0290 | Color indicator for injection |
| Morpholino | Genn Tools, LLC | (customized) | Customized designed to the gene of interest |
| Pre-pulled needle | Tritech Research | MINJ-PP | If large amount of needle is required, you can also purchase a needle puller and prepare the needle in the lab |
| T7 mMessage Kit | Ambion | 1344 | For in vitro transcription to make capped mRNA for rescue experiment |
| N-Phenylthiourea | Sigma | P7629 | For prevention of melanization |
| Tricaine | Sigma | A5040 | Also called ethyl 3-aminobenzoate, for zebrafish anesthesia |
| Methyl Cellulose | Sigma | M-0387 | For position of zebrafish |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | For purification of PCR product for cap RNA synthesis. |
| dNTP mix | Promega | U1511 | For PCR |
| Tag DNA Polymerase | Invitrogen | 10342-053 | For PCR |
| Equipment | |||
| NanoDrop sepctrophotometer | Thermo Scientific | ND-1000 | For measure morpholino and RNA concentration |
| Air Compressor | Werther International, Inc. | Panther Compact 106 | Air source for injection |
| Pico micro-injection pump | World Precision Instruments Inc | PV830 Pnematic PicoPump | Other types of microinjection system can be used. |
| Micro-manuplator | World Precision Instruments Inc | MMJR | Right-handed (MMJL for left handed) |
| Needle holder | World Precision Instruments Inc | 5430-ALL | To hold needle for micromanipulation |
| Dumont Tweezers | Fine Surgical Tools | 11253-20 | For breaking off the needle tip |
| Dissecting microscope | Leica M205C | For observing and imaging zebrafish embryos | |
| Fluorscence microscope | Zeiss Axio Obserer D1m | For imaging zebrafish pronephros | |
| Capillary tube (I.D 0.15 mm) | VitroCom | CV1525Q-100 | For measure the volume of each injected drop |
References
- Choi, S. Y., et al. Cdc42 deficiency causes ciliary abnormalities and cystic kidneys. J Am Soc Nephrol. 24 (9), 1435-1450 (2013).
- Hostetter, C. L., Sullivan-Brown, J. L., Burdine, R. D. Zebrafish pronephros: a model for understanding cystic kidney disease. Dev Dyn. 228 (3), 514-522 (2003).
- Nyengaard, J. R., Bendtsen, T. F. Glomerular number and size in relation to age, kidney weight, and body surface in normal man. Anat Rec. 232 (2), 514-201 (1992).
- Keller, G., Zimmer, G., Mall, G., Ritz, E., Amann, K. Nephron number in patients with primary hypertension. N Engl J Med. 348 (2), 101-108 (2003).
- Cullen-McEwen, L. A., Kett, M. M., Dowling, J., Anderson, W. P., Bertram, J. F. Nephron number, renal function, and arterial pressure in aged GDNF heterozygous mice. Hypertension. 41 (2), 335-340 (2003).
- Gerlach, G. F., Wingert, R. A. Kidney organogenesis in the zebrafish: insights into vertebrate nephrogenesis and regeneration. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2 (5), 559-585 (2013).
- Igarashi, P. Overview: nonmammalian organisms for studies of kidney development and disease. J Am Soc Nephrol. 16 (2), 296-298 (2005).
- Zhou, W., Boucher, R. C., Bollig, F., Englert, C., Hildebrandt, F. Characterization of mesonephric development and regeneration using transgenic zebrafish. Am J Physiol Renal Physiol. 299 (5), 1040-1047 (2010).
- Liu, S., et al. A defect in a novel Nek-family kinase causes cystic kidney disease in the mouse and in zebrafish. Development. 129 (24), 5839-5846 (2002).
- Slanchev, K., Putz, M., Schmitt, A., Kramer-Zucker, A., Walz, G. Nephrocystin-4 is required for pronephric duct-dependent cloaca formation in zebrafish. Hum Mol Genet. 20 (16), 3119-3128 (2011).
- Huang, L., et al. The role of Wnt5a in prostate gland development. Dev Biol. 328 (2), 188-199 (2009).
- Andre, P., et al. The Wnt coreceptor Ryk regulates Wnt/planar cell polarity by modulating the degradation of the core planar cell polarity component Vangl2. J Biol Chem. 287 (53), 44518-44525 (2012).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
- Torres, V. E., Harris, P. C., Pirson, Y. Autosomal dominant polycystic kidney disease. Lancet. 369 (9569), 1287-1301 (2007).
