完整的I类HLA /肽复合物是由肿瘤细胞脱落,代表了潜在的癌症相关的生物标志物。利用无标记传感器技术和T细胞受体的模仿的单克隆抗体,检测棚-MIF / HLA-A *的02:01配合在MDA-MB-231细胞上清液,掺入人血清,并且患者血浆证明,有利的发展一种新型癌症诊断平台。
据美国癌症协会,超过200,000名妇女将被诊断为每年浸润性乳腺癌和大约40,000将死于这种疾病。人类白细胞抗原(HLA)I类样本从细胞蛋白的蛋白酶体降解的肽和通过循环细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的呈现在细胞表面上对询问这些片段。的T细胞受体模拟物代(TCRM)单克隆抗体(mAb),其识别乳腺癌特异性肽/ HLA-A * 02:01配合物,例如那些由巨噬细胞迁移抑制因子(MIF 19-27)和NY-ESO-衍生1 157-165能够检测和破坏乳腺癌细胞在缺乏有效的抗肿瘤CTL应答。完整的I类HLA /肽复合物是由乳腺癌细胞脱落,代表潜在相关的癌症生物标志物。在这项工作中,对于癌症的诊断突破生物标志物筛选系统š掺入T细胞受体模拟物的单克隆抗体结合使用导模谐振(GMR)传感器技术的新颖,无标记生物传感器呈现。检测棚-MIF / HLA-A *的02:01配合在MDA-MB-231细胞上清液,掺入人血清,和患者血浆是证明。这项工作的影响,可以通过发展配套病诊断有针对性的免疫疗法彻底改变个性化的药。
从细胞内蛋白质剧目的蛋白酶体降解衍生的长度8-11个氨基酸的I类人类白细胞抗原(HLA)的样品的肽和呈现每核细胞1,2的表面上这些肽。与HLA复合体是“自然的生物标志物”,指示每个小区的健康( 图1),以循环的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。识别相关疾病肽结果消除由CTL违规细胞。因此,适应性免疫应答是消除病毒感染和肿瘤非常有效。然而,免疫系统施加压力,该压力经常促进选择的病毒或肿瘤能够回避有效的CTL反应的。 T细胞受体模仿(TCRM)单克隆抗体(mAb),其识别特定肽/ HLA-A * 02:01配合物,例如那些来自乳腺癌相关蛋白,巨噬细胞迁移抑制因子衍生(MIF19-27)3和NY-ESO-1 157-165,使得能够检测和破坏乳腺癌细胞在缺乏有效的抗肿瘤CTL应答4,5。这代表工作的重点是HLA-A * 0201分子,这是由人口高达30%来表示。然而,识别其他相关的HLA /肽复合物,接着通过生产TCRM使得能够有针对性的免疫疗法和同伴疾病诊断的发展,扩大这项工作的效用,以更广泛的人群。
开往细胞表面上的肽/ HLA复合物的一部分被释放到血浆中。由于肽/ HLA池,现有的方法为挖掘immunopeptidome用于HLA相关联的生物标志物的高度复杂性是费时的。这个过程需要从血浆可溶性HLA的亲和纯化的HLA相关肽通过反相高压液相色谱法分离(RP-HPLC)和肽测序通过串联质谱(MS / MS)6,7。虽然这个过程是一个可行的选择的新的治疗目标的发现,它是一个麻烦的过程作为对HLA相关目标已经在治疗性疫苗或生物制药管道8-10伴侣诊断工具。 TCRM针对这些目标提供了针对分层患者到相关的临床试验,并提供更明智的治疗选择快速伴随诊断的开发工具。
在这项工作中,对于癌症的诊断突破生物标志物筛选系统,提出了利用TCRM和无标记生物测定系统,用于监视以最小的处理步骤的生物相互作用。在无标记生物测定系统是基于一种方法,它利用发生在电介质波导光栅11-14的导模谐振(GMR)效应。当宽带光接触衍射光栅中所需的用于该系统的板,两个特定波长的光被反射。固定化的受体及其配体之间的结合相互作用是实时通过跟踪共振波长偏移用频谱分析仪12监测。独立共振峰发生对入射的TE(电矢量垂直于入射平面)和TM(磁矢量垂直于入射平面)偏振状态提供多个数据点可以潜在地提高检测精度11,14。在该标签的无测定系统使用抗体预致敏板,具有数据分析测定运行时间大约是45分钟。另外,多个患者样品可以询问在96或384孔格式,具有明显的优势比的HPLC-MS / MS基于格式。
本文所描述的方法引入了对癌症的诊断,这将使在高通量快速检测的病人血清,血浆,尿或唾液样品中的可溶性肽/ HLA复合体96或384孔形式的生物标记物筛选系统。这利用T细胞受体模仿单克隆抗体和一个无标记检测系统的检测系统切分析时间小于1小时相比3.5小时通过常规的ELISA。这种高通量方法使患者对治疗性癌症疫苗或生物药品临床试验的快速分层。目前的方法对这些疾病指标的检测需要个体患者的样品中,既麻烦又费时的过程的亲和纯化和HPLC-MS / MS。虽然这种方法是适合于常规ELISA技术,人们关心的是次要的检测试剂,如抗β2微球蛋白抗体可以改变新生HL的结构一个分子,抑制绑定到TCRM限制检测。无标记检测减轻这些问题。此过程可被修改为在其他无标记系统中使用,如表面等离子体共振系统。然而,相对于在该研究中使用的生物测定系统中,这会大大降低了更高的吞吐量能力。
该协议可以有效地改性的非生物标记的HLA在患者血清和血浆中的检测用粘附到几个关键步骤。初始抗体涂覆过程的监控,建议对于表面的优化,作为<200时移将很可能导致低信号用于随后的检测步骤。如血清蛋白的丰度可能掩盖低浓度分析物的结合的基线和后洗读取都为端点分析是有用的。最后,样品的温度变化可导致井到井变化。建议在所有的样品进行预温育一D中的标签自由biosassay部温度控制器设定在2-3℃的高于室温的温度下进行。冷藏样品应允许足够的时间来达到工作温度。
该协议的未来修改将包括TCRM的板面复。生物测定系统目前适合于井在至少8丛的密度点样。通过引入4-8 TCRM到每个孔中,每个测试样品体积被减少,使每名病人的日益复杂的数据的收集。这种能力可进一步告知患者对于治疗选择。
The authors have nothing to disclose.
These studies were supported in part by the Development Corporation of Abilene which provides laboratory space and salary support for Experimmune, a Center for Immunotherapeutic Development at Texas Tech University Health Sciences Center and Resonant Sensors Incorporated.
Name of the Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description (optional) |
ResoSens Label-free Bioassay Detection System | Resonant Sensors Incorporated | ||
Avidin Sensitized Bionetic 96-well Plates | Resonant Sensors Incorporated | ||
ResoVu software | Resonant Sensors Incorporated | ||
RL21A Biotinylated TCRm mAb | PureMHC, LLC | ||
RL9A Biotinylated TCRm mAb | PureMHC, LLC | ||
FLSL HLA-A*02:01 Monomer | Experimmune | full peptide sequence: FLSELTQQL | |
SLLV HLA-A*02:01 Monomer | Experimmune | full peptide sequence: SLLMWITQV | |
YLEV HLA-A*02:01 Monomer | Experimmune | full peptide sequence: YLEPGPVTV | |
KVL HLA-A*02:01 Monomer | Experimmune | full peptide sequence: KVLEYVIKV | |
Pooled Normal Human Serum | ThermoFisher | BP2657100 | |
MDA-MB-231 Cell Supernatant | ATCC | HTB-26 | Cells grown in IMDM , 10% FBS and 1% penn/strep. Supernatants harvested from 3 day confluent cultures. |
Iscove's Modification of Dulbecco's Medium (IMDM) | Life Technologies | 12440-053 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 10082-147 | |
Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15070-63 | |
Sodium Hydroxide | ThermoFisher | 5318-1 | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher | BP665-1 | |
Phosphate Buffered Saline + 0.05% Tween 20 (PBST) | ThermoFisher | BP337-500 | |
2,2’-Azinobis [3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid]-diammonium salt (ABTS) | ThermoFisher | 37615 | |
rabbit anti-human β2 microglobulin | Dako | A0072 | |
Peroxidase conjugated goat anti-rabbit IgG | Jackson Immunoresearch | 111-035-144 | |
Nunc microplates | ThermoFisher | 439454 | |
Synergy 2 microplate reader | Biotek | ||
Immpress Reagent Kit | Vector | MP-7402 | |
Immpact DAB | Vector | SK-4105 | |
Hematoxylin QS | Vector | H3403 | |
IgG2a | MP BioMedicals | 50328 | |
IgG2b | MP BioMedicals | 50330 | |
anti-HLA-A2 (BB7.2) | Experimmune | ||
Prism 5 | Graphpad |