A method for investigating the structure of a protein photoreceptor using atomic force microscopy (AFM) is described in this paper. PeakForce Quantitative Nanomechanical Property Mapping (PF-QNM) reveals intact protein dimers on a mica surface.
Atomic Force mikroskopi (AFM) bruger en pyramideformet spids fastgjort til et fremspring til at undersøge kraft reaktion en overflade. Kan måles fordrejning af spidsen til ~ 10 pN af en laser og sektoropdelt detektor, som kan omdannes til billedet topografi. Amplitudemodulation eller "trykke mode" AFM omfatter proben gør periodisk kontakt med overfladen, mens oscillerende ved sin resonansfrekvens til at producere et billede. Anvendes i forbindelse med en væske celle, trykke-mode AFM muliggør billeddannelse af biologiske makromolekyler, såsom proteiner i fysiologisk relevante betingelser. Tapping-mode AFM kræver manuel indstilling af sonden og hyppige justeringer af et væld af scanningsparametre, der kan være en udfordring for uerfarne brugere. For at opnå billeder af høj kvalitet, er disse justeringer er den mest tidskrævende.
PeakForce Kvantitativ nanomekaniske Ejendom Mapping (PF-QNM) frembringer et billede ved at måle en kraft ResponSE kurve for hvert punkt kontakt med prøven. Med ScanAsyst software, kan PF-QNM automatiseres. Denne software justerer setpunktet, drev frekvens scanning sats, gevinster og andre vigtige scanningsparametre automatisk for en given prøve. Ikke alene denne proces beskytte både skrøbelige sonder og prøver, det reducerer den tid, der kræves for at opnå billeder i høj opløsning. PF-QNM er kompatibel til AFM billeddannelse i væske; derfor, det har omfattende ansøgning til billeddannelse biologisk relevante materialer.
Den præsenteres i dette papir metode beskriver anvendelsen af PF-QNM at få billeder af en bakteriel rødt lys fotoreceptor, RpBphP3 (P3), fra fotosyntetiske R. palustris i dens lys tilpasset tilstand. Ved hjælp af denne metode, har de enkelte protein dimerer af P3 og aggregater dimerer blevet observeret på en glimmer overflade i nærværelse af en billeddannende buffer. Med passende justeringer for at overfladevand og / eller løsning koncentration, denne metodekan generelt anvendes på andre biologisk relevante makromolekyler og bløde materialer.
Atomic force mikroskopi (AFM) er blevet et meget vigtigt redskab til at undersøge de strukturelle og mekaniske egenskaber af overflader, tynde film og enkelte molekyler siden sin opfindelse i 1986 (Figur 1). 1-3 Brug en væske-celle, metoden har blive særligt nyttige i studier af biologiske makromolekyler og endda levende celler i en fysiologisk relevant miljø. 4-10 Tapping-mode AFM har traditionelt været anvendt til billeddannelse af bløde materialer eller løst bundne molekyler til overfladen, idet kontakt-mode AFM er typisk uegnet på grund til skader forårsaget af de laterale kræfter på prøven ved cantilever. 11 Tapping-mode AFM reducerer disse kræfter betydeligt ved at have tippet intermitterende røre ved overfladen snarere end at være i konstant kontakt. I denne tilstand er cantilever oscilleres ved eller i nærheden af sin resonansfrekvens, vinkelret på overfladen. Ligeledes at kontakte-mode AFM, topografi er analyzed ved at plotte bevægelsen af z-piezo som en funktion af xy (afstand).
De udkragede dynamik kan være ganske ustabil ved eller nær resonans; derfor er de meget udfordrende at automatisere uden for en "steady state" situation. Specifikt disse dynamikker afhænger både af egenskaberne prøve og scanning miljø. For en blød molekyle adsorberet til en hård (ere) overflade, kan en godt tunet returkredsløbet til molekylet medføre tilbagekoblingsoscillation til overfladen. Drift i væske komplicerer yderligere tuning af cantilever. Ændringer i temperatur eller væskestande kræver konstant justering af setpunkt, gevinster, og andre billeddiagnostiske parametre. Disse justeringer tendens til at være meget tidskrævende og udfordrende for brugerne.
Topkraft Kvantitativ nanomekaniske Ejendom Mapping (PF-QNM), ligesom aflytning tilstand AFM, undgår laterale interaktioner ved intermitterende kontakt mellem prøven (figur 2). 12-15 </ Sup> Men PF-QNM opererer i ikke-resonante mode og frekvenser meget lavere end at trykke-mode AFM. Dette eliminerer tuning udfordringer i tappe-mode AFM, især dem forværres ved tilstedeværelsen af væske. Med PF-QNM, billederne indsamles ved at tage en kraft respons kurve ved hver kontaktpunkt. Med tilføjelsen af ScanAsyst software, kan 15 justering af scanningsparametrene automatiseres og et billede i høj opløsning opnået i løbet af få minutter ved selv uerfarne brugere. Når brugeren bliver mere fortrolig med AFM, kan enhver af eller alle de automatiske parametre deaktiveres når som helst, der tillader experimentalist at finjustere billedkvaliteten manuelt. Siden starten har PF-QNM blevet anvendt til at kortlægge bacteriorhodopsin, en membran protein og andre native proteiner på submolecular niveau. 16-18 For bacteriorhodopsin, er der en direkte sammenhæng mellem protein fleksibilitet og røntgenkrystallografiske strukturer. 12 PF -QNM er blevet anvendt til at undersøge levende celler med høj opløsning. 19,20 Desuden har PF-QNM data belyst vigtige forbindelser mellem struktur og mekanik i erythrocytmembranen, der er afgørende for celle integritet og funktion. 21.
Vi har ansat scanning probe mikroskopi (SPM) metoder, 22 herunder AFM, 23 for at studere strukturen af røde lys fotoreceptorer kaldet bacteriophytochromes (BphPs). 24,25 De består af en lys sensing modul kovalent bundet til en signalering-effektor modul sådan som histidin kinase (HK). 26 lys-sensing modul indeholder typisk en Bilin chromofor som undergår strukturelle omlægning efter absorption af en foton, med en række strukturelle ændringer nåede signaleringen-effektor-modul og fører til en global omdannelse af hele proteinet . 24,27-29 Baseret på denne forandring, er der to særskilte lysabsorberende sTates af BphPs, en rød og langt rødt lys absorberende tilstand, betegnet Pr og Pfr. Pr er termisk stabil, mørke-tilpassede tilstand for de fleste BphPs. 28 molekylære grundlag for Pr / Pfr fotoomdannelse er ikke helt forstået på grund af begrænset strukturel viden om disse proteiner. Med undtagelse af en struktur fra D. radiodurans, 30 alle offentliggjorte røntgenkrystallografiske strukturer af disse proteiner er i den mørke-tilpassede tilstand og mangler effektordomæne. De intakte BphPs er for store til at blive effektivt undersøgt ved kernemagnetisk resonans (NMR) og er notorisk vanskelige at krystallisere i deres intakte form (især i lyset tilpasset tilstand) til røntgenkrystallografi. BphPs er for nylig blevet manipuleret med infrarød fluorescerende protein markører (IFP) 's. 31 Strukturel karakterisering af disse proteiner kan yderligere støtte i effektiv IFP design. 32-36
Fokus i denne artikel er at præsentere en procedure forbilleddannelse af BphPs anvender flydende-celle AFM fra PF-QNM. Fremgangsmåden er påvist ved undersøgelser af lys tilpasset tilstand bacteriophytochrome RpBphP3 (P3) fra den fotosyntetiske bakterie R. palustris. AFM procedure, der præsenteres her er praktisk og enkel tilgang til afbildning af proteiner samt andre biologiske makromolekyler. Med denne fremgangsmåde kan strukturelle detaljer af de enkelte molekyler blive samlet i en kort periode, svarende til en øvre niveau videnskab naturligvis laboratorium session. Gennem måling tværsnit og færdiggøre yderligere dimensionelle analyser, kan eksperimentelle data sammenlignes med anvendelige beregningsmodeller. 37-42
AFM er et scanning probe mikroskopi metode fuldt ud i stand til billeddannelse proteiner og andre biologiske makromolekyler i fysiologisk relevante betingelser. I sammenligning med røntgenkrystallografi og NMR-, en begrænsning af AFM er dens manglende evne til at opnå den samme opløsning, især lateral opløsning. Når du bruger AFM til at analysere et molekyle på enhver overflade, skal virkningen af overfladen og sonden på billedet af molekylet også overvejes, når data analyseres. Deconvoluting af sonden …
The authors have nothing to disclose.
NSF-MRI-programmet (CHE: 1229103) er anerkendt for at finansiere køb af nye styringselektronik, software, flydende celler og andet nødvendigt udstyr til at samle en dobbelt AFM / STM. Vi anerkender de delte faciliteter på The University of Chicago NSF-MRSEC programmet (DMR-0.820.054) for at få hjælp med AFM instrumentering, uddannelse og billedbehandling, og instrumentet tid stilles til rådighed af Materials Research Facilities Network (DMR-0.820.054). Vi især takke Dr. Qiti Guo, dr Justin Jureller, og professor Ka Yee Lee til byde vores studerende, før finansieringen af NSF-MRI forslag, der bragte den nødvendige instrumentering til vores campus. Vi anerkender finansiering fra et afsnit III STEM tilskud (ID: P031C110157) udstedt på Northeastern Illinois University, leveres sommer forsknings-stipendier for studerende og fakultet samt støtte til forbrugsstoffer. Endelig har vi erkende Bruker-Nano, Inc. for fortsat instrumentel støtte og om tilladelse til reproduce et plot, der viser mekanismen i PeakForce QNM og at bruge ordet ScanAsyst at beskrive automatiseret software.
Name of Material/Equipment | Company | Catalog # | Comments |
Tris-HCl | Fisher Scientific | O4997-100 | |
NaCl | Acros Organics | 7647-14-5 | |
MgCl2 | Acros Organics | 7791-18-6 | |
Multimode 8 AFM | Bruker-Nano | 492-008-011 | equipped with Nanoscope V controller and J scanner |
Probe | Bruker-Nano | SNL-10, ScanAsyst-Fluid+ | |
Tapping Mode Fluid Cell | Bruker-Nano | MTFML | |
Mica V-4 Grade | SPI supplies | 1150503 | 25 x 25 x .26 mm |
Sample support disk | nanoSurf | BT02236 | |
Petri dish | Plasta-Medic, Inc. | 100 mm x 15 mm | |
micropipettors | Denville Scientific | XL 3000i | |
RpBphP3 | Prepared according to cited references | ||
Nanoscope software | Bruker-Nano | ||
Fiber Optic Light | Digital Instruments Inc. | F0-50 | |
Pelco AFM Disc Gripper | Ted Pella Inc | 1668 | 12 mm |
1 ml syringe | McKesson | 102-ST1C | |
Eppendorf tubes | Denville Scientific | C2171 | |
The Pymol Molecular Graphic System v.1.5.0.1 | Schrodinger, LLC |