Atomic Force Microscopy van Red-Light Fotoreceptoren behulp PeakForce Kwantitatieve Nanomechanical Property Mapping
Summary
A method for investigating the structure of a protein photoreceptor using atomic force microscopy (AFM) is described in this paper. PeakForce Quantitative Nanomechanical Property Mapping (PF-QNM) reveals intact protein dimers on a mica surface.
Abstract
Atomic force microscopie (AFM) gebruik piramidevormige tip aan een cantilever om de kracht respons van een oppervlak sonde. De doorbuiging van de tip kan worden gemeten met ~ 10 pN door een laser en in sectoren detector, die kan worden omgezet in beeld topografie. Amplitudemodulatie of "tapping mode" AFM gaat de sonde maakt niet voortdurend contact met het oppervlak, terwijl oscillerende op zijn resonantiefrequentie om een beeld te produceren. In combinatie met een vloeistof cel, tikken-mode AFM kan de beeldvorming van biologische macromoleculen zoals eiwitten in fysiologisch relevante omstandigheden. Tikken-modus AFM vereist handmatig afstemmen van de sonde en frequente aanpassingen van een veelheid van scanning parameters die kunnen worden uitdagend voor onervaren gebruikers. Om beelden van hoge kwaliteit te verkrijgen, deze aanpassingen zijn het meest tijdrovend.
PeakForce Kwantitatieve Nanomechanical Property Mapping (PF-QNM) produceert een beeld door het meten van een kracht verantse curve voor elk punt van contact met het monster. Met ScanAsyst software, kan PF-QNM worden geautomatiseerd. Deze software past de set-point, aandrijving frequentie, scansnelheid, winsten, en andere belangrijke parameters scannen automatisch voor een bepaald monster. Niet alleen heeft deze taak beschermt fragiele probes en monsters, het vermindert de tijd die nodig hoge resolutie beelden te verkrijgen. PF-QNM is geschikt voor AFM beeldvorming in vloeistof; dus het heeft uitgebreide toepassing voor beeldvorming van biologisch relevante materialen.
De methode in dit document beschrijft de toepassing van PF-QNM om beelden van een bacteriële rosse photoreceptor, RpBphP3 (P3) te verkrijgen, uit fotosynthetische R. palustris in het licht aangepaste toestand. Met deze methode zijn individuele eiwit dimeren van P3 en aggregaten van dimeren waargenomen op een mica oppervlak in de aanwezigheid van een grafisch buffer. Met de nodige aanpassingen aan de oppervlakte en / of de concentratie van de oplossing, deze methodekunnen in het algemeen worden toegepast op andere biologisch relevante macromoleculen en zachte materialen.
Introduction
Atomaire kracht microscopie (AFM) is uitgegroeid tot een zeer belangrijk instrument voor het onderzoeken van de structurele en mechanische eigenschappen van oppervlakken, dunne films en enkele moleculen sinds de uitvinding in 1986 (figuur 1). 1-3 Met behulp van een vloeistof-cel, de methode heeft worden bijzonder bruikbaar in studies van biologische macromoleculen en zelfs levende cellen in een fysiologisch relevante omgeving. 4-10 Tapping mode AFM is van oudsher gebruikt voor beeldvorming van zachte materialen of zwak gebonden moleculen aan het oppervlak, via contact-mode AFM doorgaans ongeschikt wijten om de schade veroorzaakt door de zijdelingse krachten op het monster door de cantilever. 11 Tapping-modus AFM aanzienlijk vermindert deze krachten door het hebben van de tip met tussenpozen raak het oppervlak in plaats van constant in contact. In deze modus wordt de cantilever geoscilleerd of nabij zijn resonantiefrequentie loodrecht op het oppervlak. Net als bij contact-modus AFM, topografie is analeyzed getrokken waarbij de beweging van de z-piëzo als functie van xy (afstand).
De cantilever dynamiek kan heel instabiel zijn op of in de buurt van resonantie; daarom zijn ze zeer uitdagend om buiten een "steady-state" situatie automatiseren. Specifiek deze dynamiek afhankelijk zowel het monster eigenschappen en scanomgeving. Voor een zachte molecuul geadsorbeerd aan een vaste (re) oppervlak kan een goed afgestelde terugkoppellus voor het molecuul leiden tot feedback oscillatie van het oppervlak. Operatie in vloeistof verder compliceert de tuning van de cantilever. Veranderingen in temperatuur of vocht niveaus vereisen constante aanpassing van setpunt, winsten, en andere imaging parameters. Deze aanpassingen hebben de neiging om zeer tijdrovend en uitdagend voor de gebruikers zijn.
Peak Force Kwantitatieve Nanomechanical Property Mapping (PF-QNM), zoals mode AFM tikken, voorkomt laterale interacties door intermitterend contact van het monster (figuur 2). 12-15 </ Sup> Echter, PF-QNM actief in niet-resonante mode en frequenties veel lager dan tikken-modus AFM. Dit elimineert de stemming uitdagingen tappen-mode AFM, met name verergerd door de aanwezigheid van vocht. Met PF-QNM, worden de beelden verzameld door het nemen van een kracht responscurve op elk punt van contact. Met de toevoeging van ScanAsyst software, kan 15 aanpassing van de scan parameters worden geautomatiseerd en de afbeelding met een hoge resolutie in een kwestie van minuten, verkregen door zelfs onervaren gebruikers. Zodra de gebruiker wordt meer vertrouwd met de AFM, kan elke of alle geautomatiseerde parameters geactiveerd op elk tijdstip waarop de experimentator de beeldkwaliteit handmatig maakt fijnafstelling. Sinds haar ontstaan heeft de PF-QNM toegepast op bacteriorhodopsin, een membraaneiwit, en andere inheemse eiwitten in kaart op het submoleculaire niveau. 16-18 Voor bacteriorhodopsin, is er een direct verband tussen eiwit flexibiliteit en röntgenkristallografische structuren. 12 PF -QNM is gebruikt om levende cellen met hoge resolutie onderzocht. 19,20 Verder is PF-QNM data toegelicht belangrijke verbanden tussen structuur en mechanica binnen de erytrocyt membraan die essentieel zijn voor cel integriteit en functie. 21
We hebben scanning probe microscopie (SPM) methoden, 22 waaronder AFM, 23 de structuur van rood licht fotoreceptoren genoemd bacteriophytochromes (BphPs) bestuderen. 24,25 Ze bestaan uit een lichtgevoelige module covalent gebonden aan een signaal-effector module dergelijke histidine kinase (HK). 26 Het licht-sensing module bevat typisch een bilin chromofoor welke structurele verandering ondergaat bij absorptie van een foton met een reeks structurele veranderingen bereiken van de signalering effector-module en leidt tot een algemene verandering van het gehele eiwit . 24,27-29 basis van deze transformatie, zijn er twee verschillende lichtabsorberende sTates van BphPs, een rood en ver-rood licht absorberen staat, aangeduid als Pr en Pfr. Pr thermisch stabiel, donker aangepaste toestand voor de meeste BphPs. 28 De moleculaire basis van Pr / Pfr photoconversion niet volledig begrepen vanwege de beperkte kennis van deze structurele eiwitten. Met uitzondering van een structuur van D. radiodurans, 30 alle gepubliceerde röntgenkristallografische structuren van deze eiwitten zijn in het donker aangepaste toestand en missen effector domein. Het intacte BphPs zijn te groot om effectief bestudeerd door Nuclear Magnetic Resonance (NMR) en zijn notoir moeilijk te kristalliseren in de intacte vorm (met name in het licht aangepaste state) voor röntgenkristallografie. BphPs zijn onlangs ontworpen als infrarood fluorescerend eiwit markers (IFP). 31 Structurele karakterisering van deze eiwitten kan helpen bij het effectief IFP ontwerp verder. 32-36
De focus van dit artikel is om een procedure in te dienen voorbeeldvorming van BphPs gebruik van vloeibare-cel AFM via PF-QNM. De methode wordt aangetoond door studies van het licht aangepaste toestand van de bacteriophytochrome RpBphP3 (P3) van de fotosynthetische bacterie R. palustris. De AFM procedure hier gepresenteerde gemakkelijk en ongecompliceerd benadering voor beeldvorming van eiwitten en andere biologische macromoleculen. Met deze methode kan structurele details van afzonderlijke moleculen te halen in een korte periode van tijd, vergelijkbaar met een hoger niveau science cursus laboratoriumsessie. Door het meten van doorsneden en het invullen van verdere dimensionale analyses, kunnen experimentele gegevens worden vergeleken met bruikbare rekenmodellen. 37-42
Protocol
Representative Results
Discussion
AFM is een scanning probe microscopie methode volledig in staat de beeldvorming van eiwitten en andere biologische macromoleculen in fysiologisch relevante omstandigheden. In vergelijking met röntgenkristallografie en NMR, een beperking van AFM is het onvermogen om dezelfde resolutie, met name laterale resolutie. Bij gebruik van AFM een molecuul op elk oppervlak analyseren moet de invloed van het oppervlak en de sonde op het beeld van het molecuul worden overwogen wanneer de gegevens worden geanalyseerd. Deconvolueren …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Het NSF-MRI-programma (CHE: 1229103) is erkend voor de financiering van de aankoop van nieuwe controle-elektronica, software, vloeibare cellen, en andere apparatuur die nodig is om een dual AFM / STM monteren. Wij erkennen de gedeelde faciliteiten aan de Universiteit van Chicago NSF-MRSEC programma (DMR-0820054) voor hulp bij het AFM instrumentatie, opleiding en beeldvorming, en voor het instrument tijd ter beschikking gesteld door het Materials Research Facilities Network (DMR-0820054). Wij danken in het bijzonder Dr Qiti Guo, Dr Justin Jureller, en prof Ka Yee Lee voor het verwelkomen van onze studenten voor de financiering van de NSF-MRI-voorstel dat de nodige instrumenten naar onze campus. Wij erkennen de financiering van een titel III STEM-subsidie (ID: P031C110157) toegekend aan Northeastern Illinois University die zomer onderzoek stipendia voor studenten en docenten, alsmede ondersteuning voor verbruiksartikelen. Tot slot, we erkennen Bruker-Nano, Inc voor voortgezet instrumentele steun en toestemming om reproduce een grafiek die het mechanisme van PeakForce QNM en het woord ScanAsyst om het automatische software beschrijven.
Materials
| Name of Material/Equipment | Company | Catalog # | Comments |
| Tris-HCl | Fisher Scientific | O4997-100 | |
| NaCl | Acros Organics | 7647-14-5 | |
| MgCl2 | Acros Organics | 7791-18-6 | |
| Multimode 8 AFM | Bruker-Nano | 492-008-011 | equipped with Nanoscope V controller and J scanner |
| Probe | Bruker-Nano | SNL-10, ScanAsyst-Fluid+ | |
| Tapping Mode Fluid Cell | Bruker-Nano | MTFML | |
| Mica V-4 Grade | SPI supplies | 1150503 | 25 x 25 x .26 mm |
| Sample support disk | nanoSurf | BT02236 | |
| Petri dish | Plasta-Medic, Inc. | 100 mm x 15 mm | |
| micropipettors | Denville Scientific | XL 3000i | |
| RpBphP3 | Prepared according to cited references | ||
| Nanoscope software | Bruker-Nano | ||
| Fiber Optic Light | Digital Instruments Inc. | F0-50 | |
| Pelco AFM Disc Gripper | Ted Pella Inc | 1668 | 12 mm |
| 1 ml syringe | McKesson | 102-ST1C | |
| Eppendorf tubes | Denville Scientific | C2171 | |
| The Pymol Molecular Graphic System v.1.5.0.1 | Schrodinger, LLC |
References
- Binnig, G., Quate, C. F., Gerber, C. Atomic Force Microscope. Phys. Rev. Lett. 56, 930-933 (1986).
- Sonnenfeld, R., Hansma, P. K. Atomic-Resolution Microscopy in Water Science. 232, 211-213 (1986).
- Nikiforov, M. P., Darling, S. B. Concurrent Quantitative Conductivity and Mechanical Properties Measurements of Organic Photovoltaic Materials using AFM. J. Vis. Exp. 71, (2013).
- Bahatyrova, S. The Native Architechure of a Photosynthetic Membrane. Nature. 430, 1058-1061 (2004).
- Sturgis, J. N., Tucker, J. D., Olsen, J. D., Hunter, C. N., Niederman, R. A. Atomic Force Microscopy Studies of Native Photosynthetic Membranes. Biochem. 48, 3679-3698 (2009).
- Pelling, A. E., Li, Y., Shi, W., Gimzewski, J. K. Nanoscale visualization and characterization of Myxococcus xanthus cells with atomic force microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 102, 6484-6489 (2005).
- Viani, M. B. Probing Protein-Protein Interactions in Real-Time. Nature: Structural Biology. 7, 644-648 (2000).
- Hook, F., Kasemo, B., Grunze, M., Zauscher, S. Quantitative Biological Surface Science, Challenges and Recent Advances. ACS Nano. 2, 2428-2436 (2008).
- Thomas, G., Burnham, N. A., Camesano, T. A., Wen, Q. Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy. J. Vis. Exp. (76), (2013).
- Murphy, P. J. M., Shannon, M., Goertz, J. Visualization of Recombinant DNA and Protein Complexes Using Atomic Force Microscopy. J. Vis. Exp. (53), (2011).
- Poggi, M. A. Scanning Probe Microscopy. Anal. Chem. 76, 3429-3444 (2004).
- Rico, F., Su, C., Scheuring, S. Mechanical Mapping of Single Membrane Proteins at Submolecular Resolution. Nano Letters. 11, 3983-3986 (2012).
- Foster, B. The State of Microscopy for 2012. Amer. Lab. 43, 4-6 (2011).
- Guzman, H. V., Perrino, A. P., Garcia, R. Peak Forces in High-Resolution Imaging of Soft Matter in Liquid. ACS Nano. 7, 3198-3204 (2013).
- Kaemmer, S. B. Introduction to Bruker’s ScanAsyst and PeakForce Tapping AFM Technology. , (2011).
- Dufrêne, Y. F., Martinez-Martin, D., Medalsy, I., Alsteens, D., Muller, D. J. Multiparametric imaging of biological systems by force-distance curve-based AFM. Nature Methods. 10, 847-854 (2013).
- Pfreundschuh, M., Martinez-Martin, D., Mulvihill, E., Wegmann, S., Muller, D. J. Multiparametric high-resolution imaging of native proteins by force-distance curve–based AFM. Nature Protocols. 9, 1113-1130 (2014).
- Pfreundschuh, M., Alsteens, D., Hilbert, M., Steinmetz, M. O., Muller, D. J. Localizing Chemical Groups while Imaging Single Native Proteins by High-Resolution Atomic Force Microscopy. Nano Letters. 14, 2957-2964 (2014).
- Berquanda, A. Atomic Force Microscopy Imaging of Living Cells. Microscopy Today. 18, 8-14 (2010).
- Heua, C., Berquand, A., Elie-Cailleb, C., Nicoda, L. Glyphosate-induced Stiffening of HaCaT Keratinocytes, a Peak Force Tapping Study on Living Cells. J. Struc. Biol. 178, 1-7 (2012).
- Picas, L., Rico, F., Deforet, M., Scheuring, S. Structural and Mechanical Heterogeneity of the Erythrocyte Membrane Reveals Hallmarks of Membrane Stability. ACS Nano. 7, 1054-1063 (2013).
- Tobias, F. G. Scanning Probe Microscopy of Bacterial Red-Light. Proc. 1465, doi:10.1557/opl.2012.1006. , (2012).
- Sorenson, B. A. Domain Structure of a Unique Bacterial Red Light Photoreceptor as Revealed by Atomic Force Microscopy. Mater. Res. Soc. Symp. Proc. 1652, (2013).
- Rockwell, N. C., Lagarias, J. C. The structure of phytochrome: a picture is worth a thousand spectra. Plant Cell. 18, 4-14 (2006).
- Rockwell, N. C., Shang, L., Martin, S. S., Lagarias, J. C. Distinct classes of red/far-red photochemistry within the phytochrome superfamily. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106, 6123-6127 (2009).
- Noack, S., Michael, N., Rosen, R., Lamparter, T. Protein conformational changes of Agrobacterium phytochrome Agp1 during chromophore assembly and photoconversion. Biochem. 46, 4164-4176 (2007).
- Noack, S., Lamparter, T. Light modulation of histidine-kinase activity in bacterial phytochromes monitored by size exclusion chromatography, crosslinking, and limited proteolysis. Methods of Enzymology. 423, 203-221 (2007).
- Rockwell, N. C., Su, Y. S., Lagarias, J. C. Phytochrome structure and signaling mechanisms. Annual Review Plant Biology. 57, 837-856 (2006).
- Bhoo, S. H., Davis, S. J., Walker, J., Karniol, B., Vierstra, R. D. Bacteriophytochromes Are Photochromic Histidine Kinases Using a Biliverdin Chromophore. Nature. 414, 776-779 (2001).
- Takala, H. Signal amplification and transduction in phytochrome photosensors. Nature. 509, 245-248 (2014).
- Filonov, G. S. Stable Near-Infared Fluorescent Protein for in vivo Imaging. Nature Biotech. 29, 757-761 (2011).
- Samma, A. A., Johnson, C. K., Song, S., Alvarez, S., Zimmer, M. On the Origin of Fluorescence in Bacteriophytochrome Infrared Fluorescent Proteins. J. Phys. Chem. B. 114, 15362-15369 (2011).
- Lehtivuori, H. Fluorescence Properties of the Chromophore-Binding Domain of Bacteriophytochrome from Deinococcus radiodurans. J. Phys. Chem. B. 117, 11049-11057 (2013).
- Toh, K. C. Primary Reactions of Bacteriophytochrome Observed with Ultrafast Mid-Infrared Spectroscopy. J. Phys. Chem. A. 115, 3778-3786 (2011).
- Auldridge, M. E., Satyshur, K. A., Anstrom, D. M., Forest, K. T. Structure-guided engineering enhances a phytochrome-based infrared fluorescent protein. J. Biol. Chem. 287, 7000-7009 (2012).
- Toh, K. C., Stojkovic, E. A., van Stokkum, I. H., Moffat, K., Kennis, J. T. Proton-transfer and hydrogen-bond interactions determine fluorescence quantum yield and photochemical efficiency of bacteriophytochrome. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 107, 9170-9175 (2010).
- . The Pymol Molecular Graphic System v.1.5.0.1. , .
- Yang, X., Stojkovic, E. A., Kuk, J., Crystal Moffat, K. structure of the chromophore binding domain of an unusual bacteriophytochrome, RpBphP3, reveals residues that modulate photoconversion. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104, 12571-12576 (2007).
- Yang, X., Kuk, J., Moffat, K. Crystal structure of Pseudomonas aeruginosa bacteriophytochrome: photoconversion and signal transduction. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 14715-14720 (2008).
- Woitowich, N. K., Garrido, C., Ozarowski, W., Stojkovic, E. A. Preliminary X-ray Crystallographic and Structural Analyses of a Bacteriophytochrome from Stigmatella aurantiaca. The FASEB Journal. 25, 928 (2011).
- Wagner, J. R., Zhang, J., Brunzelle, J. S., Vierstra, R. D., Forest, K. T. High resolution structure of Deinococcus bacteriophytochrome yields new insights into phytochrome architecture and evolution. J. Biol. Chem. 282, 12298-12309 (2007).
- Wagner, J. R. Mutational analysis of Deinococcus radiodurans bacteriophytochrome reveals key amino acids necessary for the photochromicity and proton exchange cycle of phytochromes. J. Biol. Chem. 283, 12212-12226 (2008).
