<em> Ex Vivo</em> Лазерно-индуцированное Травма спинного мозга модель для оценки Механизмы дегенерации аксонов в режиме реального времени
Summary
We present a protocol utilizing two-photon excitation time-lapse microscopy to simultaneously visualize the dynamics of axon and myelin injuries in real time. This proposed protocol permits studies of both intrinsic and extrinsic factors which can influence central myelinated axon fate after injury and contribute to permanent clinical disability.
Abstract
Пострадавшие аксоны ЦНС не восстановить, и часто отказаться от места повреждения. Аксоны избавлены от первоначальной травмы в дальнейшем могут подвергаться вторичной дегенерацию аксонов. Отсутствие образования конуса роста, регенерации, и потери дополнительных миелиновых аксонов прогнозов в спинном мозге значительно ограничивает неврологического восстановления после травмы. Для оценки центрального миелиновые аксоны спинного мозга реагировать на травмы, мы разработали экс естественных условиях живут спинного модель мозга с использованием трансгенных мышей, которые выражают желтый флуоресцентный белок в аксоны и очаговых и хорошо воспроизводимый лазерно-индуцированной травмы спинного мозга к документу судьбу аксонов и миелина (липофильные флуоресцентный краситель Нил красный) с течением времени с использованием двух-фотонной возбуждения покадровой микроскопии. Динамические процессы, такие как острый аксонов травмы, аксонального втягивания и миелиновой дегенерации лучше всего изучать в реальном времени. Тем не менее, без очаговый характер контузии основе травм и артефактов движения столкнулсяво в естественных условиях спинного изображения шнур марки дифференциации первичных и вторичных аксонов ответов травмы, используя микроскопия высокого разрешения сложной задачей. Экс естественных условиях модель спинного мозга, описанный здесь имитирует некоторые аспекты клинически значимых контузии / сжатия, вызванного аксонов патологий, включая аксонов отек, сфероида образования, аксонов перерезки и пригородных аксонов отек обеспечивая полезную модель для изучения этих динамических процессов в режиме реального времени. Основные преимущества этой модели отлично пространственно-временной резолюции, который позволяет дифференцировать между первичной оскорбление, которые непосредственно повреждает аксоны и механизмы вторичного повреждения; контролируется вливания реагентов непосредственно в перфузат купания мозга; точные изменения в экологическом среде (например, кальция, ионы натрия, известные вкладчики аксонов травмы, но практически невозможно манипулировать в естественных условиях); и мышиные модели также имеют преимущество, поскольку они обеспечивают возможность визуализации иманипулировать генетически определенных популяций клеток и субклеточных структур. Здесь мы опишем, как изолировать и изображение живых спинного мозга у мышей, чтобы захватить динамику острого аксонов травмы.
Introduction
Вырождение аксонов из основных причин заболеваемости охватывающих несколько неврологических заболеваний, включая нейротравме, инсульта, аутоиммунных и нейродегенеративных заболеваний. В отличие от периферической нервной системы (ПНС), центральной нервной системы (ЦНС) аксоны имеют ограниченные возможности к регенерации однажды ранил из-за как внутренних, так и внешних барьеров (например, тормозные молекул рост аксонов, образующихся при формировании рубцовой и выделяющейся при миелиновой дегенерации) 1 -7. Хотя некоторые из этих барьеров были широко изучены, терапевтические мероприятия, направленные на предотвращения ЦНС дегенерацию аксонов, способствуют надежной регенерацию аксонов, и восстановить функциональную соединительно, остаются ограниченными.
Аксоны После отделения от их сомы пройти стереотипное процесс перерождения известного как валлеровский дегенерации, которая характеризуется аксонов отек, сфероида образования и в конечном итоге фрагментации (обзор 8). Вконтраст, проксимальный культи, что остается в непрерывности с сомы о пересечённого периферической аксона, формирует отек на его конце, отмирает до ближайшей перехвата Ранвье, а затем может инициировать образование роста конуса, жизненно необходимым условием необходимым для последующей регенерации аксонов 9-11. В отличие от этого, проксимальные аксонов окончаний многих центральных аксонов образуют характерные "endbulbs" или луковицы отвода не образуют конусы роста, и вместо того, чтобы убрать от места повреждения, где они остаются в течение нескольких месяцев после травмы 12-15. В дополнение к основной аксонов травмы, дополнительное повреждение аксонов / потери могут также происходить в аксонов, которые были в значительной степени избавлены от начальной травмы. Это задержка аксонов потери изначально избавлены аксонов называют вторичной дегенерации аксонов. Это неотъемлемое ответ ЦНС аксонов травмы оказывает функциональных регенерации аксонов еще более труднодостижимой целью достижения в головном и спинном мозге.
Хотя гаllmarks аксонов травмы (например, сфероида образования, луковицы отвода) были охарактеризованы с посмертной ткани и экспериментальных моделей дегенерации аксонов, выяснение молекулярных механизмов, лежащих в основе этих динамических процессов была ограничена. Большинство этих исследований использовали такие статические конечных наблюдений, которые по своей сути не смогли захватить отдельные аксонов ответов с течением времени. Хотя экзогенно применяется аксонов индикаторы оказались полезными для выяснения ответов аксонов от статических разделов и во время живого изображения, наличие генетически кодируемых аксонов маркеров значительно улучшили нашу способность визуализировать аксоны в режиме реального времени с помощью флуоресцентной микроскопии. Действительно, основополагающем докладе от Kerschensteiner и коллег-первых условии прямых доказательств дегенерации аксонов и регенерацию в естественных условиях с использованием Thy1 -GFP-S мышей, которые кодируют зеленый флуоресцентный белок в подмножеств нейронов, которые посылают свои прогнозы в спинной колонкам позвоночникашнур 16. Живая съемка подходов с использованием двух фотонных лазерной сканирующей микроскопии (TPLSM) и генетических флуоресцентный белок маркировки клеток, представляющих интерес продолжает оказывать прямое доказательство и механических понимание многих различных динамических процессов, таких как дегенерации аксонов, Ca 2+ сигнализации, регенерации аксонов, астроцитов физиологии, микроглии физиологии и ответ на повреждение 17-25.
В отличие от аксонов, очень мало известно ответов миелиновых травмы в режиме реального времени. Миелин является жизненно важным компонентом белого вещества создан и поддерживается олигодендроцитах в клетках ЦНС и Шванновских в ПНС. Миелин изолирует 99% поверхности аксонов и тем самым обеспечивает высокую сопротивления, малой емкости защитное покрытие, которое поддерживает быстрое и эффективное Сальтаторные распространение импульса, недавно рассматривался Buttermore и др. 26. Чтобы захватить динамические характеристики миелина на повреждение, мы используем сольватохромные, липофильныхфлуоресцентный краситель Нила Red 27. Сольватохромных свойства этого витальной окраски позволяют спектральные сдвиги его спектра излучения, которая зависит от физико-химической среде 28,29. Эти свойства полезны, чтобы разобраться в механизмах axomyelinic травмы и может быть визуализированы с помощью соответствующим образом выбранных дихроичными и фильтры выбросов или разрешено с помощью спектрального микроскопа 27. Например, спектр излучения Найл Ред является сине-смещается в менее полярных липидов богатых средах, таких как те, что в адипоцитах и нормальной миелина ЦНС (максимум излучения ~ 580-590 нм) 27. В отличие от этого, пики спектра излучения этой жизненно важной красителя по крайней ~ 625 нм endbulbs, образующихся в аксонов подвергаются аксонов отмирание 27. Хотя точные механизмы, лежащие в основе этих спектральных сдвигов в частности, в endbulbs по сравнению с нормальной миелина остаются неясными, такие спектральные изменения могут выявить основные изменения в накоплении белка или дезорганизации, ведущего квоздействие гидрофобных сайтов связывания 27.
В то время как изображения в естественных это конечная метрика для наблюдения спинного мозга динамику аксонов травмы в их родной среде, это технически сложным и требует значительных хирургического опыта, и часто повторяют операции, чтобы разоблачить спинной колонки, которые могут представить экспериментальные артефакты (например, воспаление рубцовой формирование). Кроме того, дорогостоящего оборудования часто требуется, чтобы подвески и позиционирование интактного животного под микроскопом объектива. Животные должны быть тщательно проверены, а чтобы они оставались теплыми, чтобы обеспечить жидкости пополняется, и гарантировать, что нет никаких признаков гипоксии из-за длительного наркозом сессий визуализации. Последнее чрезвычайно важно, так как аксоны и миелиновых абсолютно требует постоянного перфузии и адекватные уровни кислорода, чтобы оставаться жизнеспособными. Тем не менее, это часто не сообщается или контролируются в наиболее естественных условиях исследования вДата. Кроме того, артефакты движения из-за сердечного ритма и дыхания (ИФ анестезии взрослой мыши: ~ 300-450 ударов в минуту (BPM) является оптимальным для поддержания 97-98% насыщения кислородом (нормальная скорость ~ 632 BPM) и ~ 55-65 вдохов в мин (нормальная скорость составляет ~ 163 вдохов в минуту), соответственно)) 30 столкнулись во время в естественных условиях спинного марки изображений шнур дифференциации первичных и вторичных аксонов ответов травмы при высоком разрешении флуоресцентной микроскопии трудно, так как даже самые быстрые лазерного сканирования неизбежно подчиняются этим движением артефакты. Успехи в сверхбыстрых резонансных сканеров в сочетании с имплантируемого твердого позвоночника в рамке окна может позволить визуализации мышиного спинного мозга у бодрствующих животных, но раз быстрее сканирования неизбежно уменьшить отношение сигнал-шум качество изображения унижающие. Дальнейшие улучшения в методах визуализации спинного мозга, в настоящее время используются для визуализации головного мозга может преодолеть многие из этих препятствий и ограничить потенциальные смешивает вносимые INAdequate тканевой перфузии, например, 31-33.
Многое из того, что известно о белого вещества физиологии и механизмов белого травмы вещества была определена с использованием в пробирке или бывших естественных препаратов белого вещества из зрительного нерва, периферического нерва, и полоски спинного мозга белом веществе 34-41. Эти препараты продолжают продвигать наши знания о белых механизмов травмы от того, как они позволяют контролируются изменения в экологических факторов, контролируемое применение лекарственных препаратов и реагентов, функциональные оценок с использованием электрофизиологии, а прямые флуоресцентной микроскопии наблюдения аксонов и миелина в живой ткани. Тем не менее, некоторые прежние подходы наблюдать аксоны от спинного мозга полос спинной колонки или брюшной полос белого вещества неизбежно травмировать поверхности аксонов на стадии удаления, которые могут повлиять на реакцию тесно отличие аксонов. Чтобы воспользоваться экспериментальными манипуляции над и избежать повреждения веRy волокна под следствием, мы используем Экс Vivo шейного отдела спинного модель мозга, так как предотвращает непосредственный контакт спинной части мозга. Таким образом, архитектура мягкой мозговой оболочки и прилегающих поверхностной дорсальной аксонов столбцов остаются жизнеспособными и невозмутимо во время изоляции.
Здесь мы описываем относительно простой подход, который позволяет непосредственно наблюдать центральных миелиновых аксонов, как они динамически реагировать на фокальной травмы в режиме реального времени до 8 – 10 + часов после травмы. Травмы спинного мозга (Lisci) модель лазерно-индуцированной позволяет дифференцировать между первичными и вторичными механизмов аксонов травмы, первичное поражение (абляции сайта) остается пространственно ограниченных во времени. Изображения камеры открытым ванна доступна терапевтического вмешательства, доставка реагентов и экологических манипуляций. Предполагаемые axomyelinic защитные агенты могут быть быстро оценены в реальном времени с помощью прямых наблюдений по сравнению с длительных и дорогостоящих экспериментов, связанных с процессом тканейING, секционирования, иммуноокрашивания, захват изображения, и анализ, и, следовательно, обеспечивает полезную суррогатной модели для оценки острых ответов и защитные манипуляции перед тестированием экспериментальные агентов в живых животных.
Protocol
Representative Results
Discussion
Мы описываем метод визуализации Экс Vivo спинного мозга мякотных аксоны (то есть, худой пучке) в сочетании с повреждением спинного мозга лазерно-индуцированной исследовать динамические прогрессии как первичного, так и вторичного миелиновые аксонов дегенерации с течением врем…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
DPS acknowledges past and present support in part from grant #2665 and #2934, respectively, from the PVA Research Foundation. PKS is an Alberta Innovates – Health Solutions Scientist, operating funds were provided by the Leblanc Chair for Spinal Cord Research, University of Calgary.
Materials
| Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Large bath chamber with slice supports | Warner Instruments | RC-27L | For ex vivo imaging chamber |
| Standard Slice Supports | Warner Instruments | SS-3 | For ex vivo imaging chamber |
| Plastic Slice hold-down for RC-27L and RC-29 chambers | Warner Instruments | SHD-27LP/10 | For ex vivo imaging chamber |
| Suction Tube, Series 20 Classic Design, left handed | Warner Instruments | ST-1L | For ex vivo imaging chamber |
| Solution In-line heater/cooler | Warner Instruments | SC-20 | To regulate perfusate temperature during imaging |
| Bipolar temperature controller | Warner Instruments | CL-100 | To regulate perfusate temperature during imaging |
| Liquid Cooling System | Warner Instruments | LCS-1 | To regulate perfusate temperature during imaging |
| Cable assembly for heater controllers | Warner Instruments | CC-28 | To regulate perfusate temperature during imaging |
| Replacement bead thermisitor for CC-28 cable | Warner Instruments | TS-70B | To regulate perfusate temperature during imaging |
| Magnetic holder with suction tubing | Bioscience Tools | MTH-S | To hold the stainless steel vacuum suction tubing |
| Adjustable holder | Bioscience Tools | MTH | To hold the temperature probe |
| clear silicone sealant | For ex vivo imaging chamber | ||
| superglue | For ex vivo imaging chamber | ||
| thin plexiglass strips | For ex vivo imaging chamber | ||
| nile red | Life Technologies | N-1142 | For labeling myelin |
References
- Chew, D. J., Fawcett, J. W., Andrews, M. R. The challenges of long-distance axon regeneration in the injured CNS. Prog Brain Res. 201, 253-294 (2012).
- Eva, R., Andrews, M. R., Franssen, E. H., Fawcett, J. W. Intrinsic mechanisms regulating axon regeneration: an integrin perspective. Int Rev Neurobiol. 106, 75-104 (2012).
- McCall, J., Weidner, N., Blesch, A. Neurotrophic factors in combinatorial approaches for spinal cord regeneration. Cell Tissue Res. 349, 27-37 (2012).
- Pernet, V., Schwab, M. E. The role of Nogo-A in axonal plasticity, regrowth and repair. Cell Tissue Res. 349, 97-104 (2012).
- Bradbury, E. J., et al. Chondroitinase ABC promotes functional recovery after spinal cord injury. Nature. 416, 636-640 (2002).
- Cregg, J. M., et al. Functional regeneration beyond the glial scar. Exp Neurol. 253, 197-207 (2014).
- Park, K. K., et al. Promoting axon regeneration in the adult CNS by modulation of the PTEN/mTOR pathway. Science. 322, 963-966 (2008).
- Coleman, M. P., Freeman, M. R. Wallerian degeneration, wld(s), and nmnat. Annu Rev Neurosci. 33, 245-267 (2010).
- Sulaiman, W., Gordon, T. Neurobiology of peripheral nerve injury, regeneration, and functional recovery: from bench top research to bedside application. Ochsner J. 13, 100-108 (2013).
- Bradke, F., Fawcett, J. W., Spira, M. E. Assembly of a new growth cone after axotomy: the precursor to axon regeneration. Nat Rev Neurosci. 13, 183-193 (2012).
- Erturk, A., Hellal, F., Enes, J., Bradke, F. Disorganized microtubules underlie the formation of retraction bulbs and the failure of axonal regeneration. J Neurosci. 27, 9169-9180 (2007).
- Seif, G. I., Nomura, H., Tator, C. H. Retrograde axonal degeneration ‘dieback’ in the corticospinal tract after transection injury of the rat spinal cord: a confocal microscopy study. J Neurotrauma. 24, 1513-1528 (2007).
- Fishman, P. S., Mattu, A. Fate of severed cortical projection axons. J Neurotrauma. 10, 457-470 (1993).
- McPhail, L. T., Stirling, D. P., Tetzlaff, W., Kwiecien, J. M., Ramer, M. S. The contribution of activated phagocytes and myelin degeneration to axonal retraction/dieback following spinal cord injury. Eur J Neurosci. 20, 1984-1994 (2004).
- Stirling, D. P., et al. Minocycline treatment reduces delayed oligodendrocyte death, attenuates axonal dieback, and improves functional outcome after spinal cord injury. J Neurosci. 24, 2182-2190 (2004).
- Kerschensteiner, M., Schwab, M. E., Lichtman, J. W., Misgeld, T. In vivo imaging of axonal degeneration and regeneration in the injured spinal cord. Nat Med. 11, 572-577 (2005).
- Kalb, J., Nielsen, T., Fricke, M., Egelhaaf, M., Kurtz, R. In vivo two-photon laser-scanning microscopy of Ca2+ dynamics in visual motion-sensitive neurons. Biochem Biophys Res Commun. 316, 341-347 (2004).
- Hirase, H., Qian, L., Bartho, P., Buzsaki, G. Calcium dynamics of cortical astrocytic networks in vivo. PLoS Biol. 2, 96 (2004).
- Fenrich, K. K., Weber, P., Rougon, G., Debarbieux, F. Long- and short-term intravital imaging reveals differential spatiotemporal recruitment and function of myelomonocytic cells after spinal cord injury. J Physiol. 591, 4895-4902 (2013).
- Canty, A. J., et al. In-vivo single neuron axotomy triggers axon regeneration to restore synaptic density in specific cortical circuits. Nat Commun. 4, 2038 (2013).
- Dibaj, P., et al. NO mediates microglial response to acute spinal cord injury under ATP control in vivo. Glia. 58, 1133-1144 (2010).
- Davalos, D., et al. Stable in vivo imaging of densely populated glia, axons and blood vessels in the mouse spinal cord using two-photon microscopy. J Neurosci Methods. 169, 1-7 (2008).
- Nimmerjahn, A. Two-photon imaging of microglia in the mouse cortex in vivo. Cold Spring Harb Protoc. 2012, (2012).
- Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo. Science. 308, 1314-1318 (2005).
- Davalos, D., et al. Fibrinogen-induced perivascular microglial clustering is required for the development of axonal damage in neuroinflammation. Nat Commun. 3, 1227 (2012).
- Buttermore, E. D., Thaxton, C. L., Bhat, M. A. Organization and maintenance of molecular domains in myelinated axons. J Neurosci Res. 91, 603-622 (2013).
- Stirling, D. P., et al. Toll-like receptor 2-mediated alternative activation of microglia is protective after spinal cord injury. Brain. 137, 707-723 (2014).
- Greenspan, P., Fowler, S. D. Spectrofluorometric studies of the lipid probe, nile red. J Lipid Res. 26, 781-789 (1985).
- Greenspan, P., Mayer, E. P., Fowler, S. D. Nile red: a selective fluorescent stain for intracellular lipid droplets. J Cell Biol. 100, 965-973 (1985).
- Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia. Cold Spring Harb Protoc. 2011, (2011).
- Tajima, Y., et al. Cerebral hemodynamic response to acute hyperoxia in awake mice. Brain Res. 1557, 155-163 (2014).
- Andermann, M. L., et al. Chronic cellular imaging of entire cortical columns in awake mice using microprisms. Neuron. 80, 900-913 (2013).
- Nimmerjahn, A., Mukamel, E. A., Schnitzer, M. J. Motor behavior activates Bergmann glial networks. Neuron. 62, 400-412 (2009).
- Tsutsui, S., Stys, P. K. Metabolic injury to axons and myelin. Exp Neurol. 246, 26-34 (2013).
- Matute, C., Ransom, B. R. Roles of white matter in central nervous system pathophysiologies. ASN Neuro. 4, (2012).
- Matute, C. Calcium dyshomeostasis in white matter pathology. Cell Calcium. 47, 150-157 (2010).
- Stys, P. K., Lipton, S. A. White matter NMDA receptors: an unexpected new therapeutic target. Trends Pharmacol Sci. 28, 561-566 (2007).
- Baltan, S. Surviving anoxia: a tale of two white matter tracts. Crit Rev Neurobiol. 18, 95-103 (2006).
- Stirling, D. P., Stys, P. K. Mechanisms of axonal injury: internodal nanocomplexes and calcium deregulation. Trends Mol Med. 16, 160-170 (2010).
- Wang, H., Fu, Y., Zickmund, P., Shi, R., Cheng, J. X. Coherent anti-stokes Raman scattering imaging of axonal myelin in live spinal tissues. Biophys J. 89, 581-591 (2005).
- Beirowski, B., Nogradi, A., Babetto, E., Garcia-Alias, G., Coleman, M. P. Mechanisms of axonal spheroid formation in central nervous system Wallerian degeneration. J Neuropathol Exp Neurol. 69, 455-472 (2010).
- Shi, R., Asano, T., Vining, N. C., Blight, A. R. Control of membrane sealing in injured mammalian spinal cord axons. J Neurophysiol. 84, 1763-1769 (2000).
- Stirling, D. P., Cummins, K., Wayne Chen, ., R, S., Stys, P. Axoplasmic reticulum Ca(2+) release causes secondary degeneration of spinal axons. Ann Neurol. 75, 220-229 (2014).
