Herstellung und Verwendung von Lentivirus, um selektiv zu transduzieren Primäre Oligodendrozyten Vorläuferzellen für<em> In-vitro-</em> Myelinisierung Assays
Summary
Here we present protocols that offer a flexible and strategic foundation for virally manipulating oligodendrocyte precursor cells to overexpress proteins of interest in order to specifically interrogate their role in oligodendrocytes via the in vitro model of central nervous system myelination.
Abstract
Myelinisierung ist ein komplexer Prozess, der beide Neuronen und das Myelin bilden Gliazellen umfasst, Oligodendrozyten im zentralen Nervensystem (ZNS) und Schwann-Zellen im peripheren Nervensystem (PNS). Wir verwenden ein in vitro Assay Myelinisierung, ein etabliertes Modell für die Untersuchung CNS Myelinisierung in vitro. Um dies zu tun, werden Oligodendrozyten-Vorläuferzellen (OPC), um die gereinigte primäre Nager dorsalen Wurzelganglien (DRG) Neuronen hinzugefügt myelinisierenden Kokulturen bilden. Um spezifisch zu verhören, die Rollen, die bestimmte Proteine, die von Oligodendrozyten exprimiert auf Myelinisierung auszuüben haben wir Protokolle, die selektiv zu transduzieren OPCs mit dem Lentivirus überexprimieren Wildtyp, konstitutiv aktiv oder dominant negative Proteine, bevor sie auf die DRG-Neuronen ausgesät entwickelt. So können wir gezielt befragen die Rolle dieser Proteine bei der Regulierung oligodendroglialen Myelinisierung. Die Protokolle können auch bei der Untersuchung von ot aufgetragen werdenihren Zelltypen und bietet somit einen Ansatz, der selektiven Manipulation von Proteinen durch einen gewünschten Zelltyp exprimiert wird, wie beispielsweise Oligodendrozyten, für die gezielte Untersuchung von Signalisierungs- und Kompensationsmechanismen ermöglicht. Zusammenfassend, die Kombination der In-vitro-Assays mit Myelinisierung lentiviralen infiziert OPCs eine strategisches Instrument für die Analyse der molekularen Mechanismen in Myelinisierung beteiligt.
Introduction
Myelinisierung von Axonen ist entscheidend für die schnelle und effiziente Übertragung von Aktionspotentialen in den beiden zentralen und peripheren Nervensystemen. Spezialisierte Zellen, Schwann-Zellen im peripheren Nervensystem und Oligodendrozyten im zentralen Nervensystem, Wrap-around und ensheathe Axone im Myelin, effektiv Isolierung der Nerven und saltatorische Erregungsleitung 1 zu erleichtern. Der Prozess der Myelinisierung in vitro unter Verwendung von retinalen Ganglienneuronen 2, konstruiert Nanofasern 3 oder Dorsalwurzelganglionneuronen cokultiviert entweder mit Schwannschen Zellen 4 oder Oligodendrozyten 5-7 untersucht werden. Die In-vitro-Assay Myelinisierung ist ein etabliertes Modell für die Untersuchung des Nervensystems Myelinisierung und viele der grundlegenden Prozesse, die während der Myelinisierung in vivo 8.5 auftreten repliziert. Der Test beinhaltet die Co-Kultur von gereinigten Populationen von Spinalganglion (DRG) Neuronen, mit OPC (für C-NS Myelinisierung) oder Schwann-Zellen (für PNS Myelinisierung). Unter bestimmten Bedingungen sind diese Zellen myelinisierenden ensheathe DRG Axone im befahl, ultra strukturell überprüft, multilamellaren Folie aus isolierendem Plasmamembran, die die gleiche Ergänzung von Myelin in vivo vorhanden spezifische Proteine zu exprimieren.
Das am häufigsten verwendete Zellmodell zu studieren CNS Myelinisierung in vitro ist die Co-Kulturen von DRG-Neuronen und OPCs, die erfolgreich verwendet wurden, um den Effekt, dass exogene Faktoren wie Neurotrophine auszuüben auf CNS Myelinisierung in vitro 5,6 studieren. Exogene Faktoren, wie Wachstumsfaktoren oder kleines Molekül pharmakologische Inhibitoren wurde weithin verwendet, um die Rolle von Signalwegen in der Myelinisierung mit der DRG-OPC Kokulturmodell 7,9 studieren. Jedoch in den Misch Kokultur Einstellungen, die sowohl die Neuronen und Oligodendrozyten enthalten, formell möglich blieb, daß entweder die Wachstumsfaktoren oder die pharmacological Inhibitoren könnte Auswirkungen auf sowohl die DRG-Neuronen und Oligodendrozyten (OL) ausgeübt haben. Hier bietet sich die Möglichkeit, gezielt zu sezieren die Rolle, dass die Proteine nur durch DRGs ausdrücklich oder Oligodendroglia übt auf die Myelinisierung mit dieser Zwei-Zellen-System. Um zweifelsfrei bestätigen, dass der Signalweg in oligodendroglialen Myelinisierung, lentivirale Transduktion OPCs vor auf DRG-Neuronen für die In-vitro-Assays Myelinisierung Aussaat, hat sich eine elegante Möglichkeit, sowohl Wildtyp und mutierten Proteine überexprimiert werden, aber auch direkt reguliert als Zuschlags Ausdruck konstitutiv exprimierten Proteine, die von Oligodendrozyten. Damit bietet dieser Ansatz einen Weg, um gezielt abzufragen und zu manipulieren Signalwege innerhalb Oligodendrozyten zum Studium Myelinisierung 9,10.
In diesem Papier Methoden, die wir selektiv in Oligodendrozyten über einen lentiviralen wurden entwickelt, um ein Protein von Interesse überexprimiert berichten wirAnsatz für das Studium Myelinisierung in vitro. Die Technik beginnt mit der Erzeugung von Expressionsvektoren, die das Gen von Interesse enthält, sei es in einem Wildtyp, konstitutiv aktiven oder dominant negative Form, die dann anschließend in der pENTR Vektor (pENTR L1-L2 pENTR4IRES2GFP) kloniert werden. Dieser Vektor (der das Gen von Interesse), sind der CMV-Promotor-Donor (pENTR L4-R1 pENTR-pDNOR-CMV) und das 2K7 lentivector in einer Enzymreaktion kombiniert, um eine 2K7 Vektor, CMV-Promotor, das Gen von Interesse, ein produzieren interne Ribosomenbindungsstelle und GFP (Abbildung 1). Diese Gateway-geklonten 2K7 Konstrukt kombiniert mit der PMD2.G Virushülle und dem pBR8.91 Virus-Paket kann in HEK293T-Zellen cotransfiziert, um Lentiviren, die später verwendet werden, um OPCs transduzieren erzeugen. Einmal mit dem Lentivirus infiziert die OPCs Ausdruck ein hohes Maß an das Protein von Interesse. Diese OPC kann dann auf DRG Neuronenkulturen ausgesät werden und die Wirkung, dass die Expressionvon hohen Niveaus des gewünschten Proteins übt auf die Myelinisierung abgefragt werden. Die Co-Kulturen werden auf Myelin-Protein-Expression durch Western-Blot-Analyse untersucht und für die Bildung von myelinisierten Axonen Segmente durch Immunzytochemie visualisiert.
Protocol
Representative Results
Discussion
Myelinisierung von Axonen ist eine entscheidende Prozess für die optimale Funktion von sowohl den zentralen und peripheren Nervensystems von Wirbeltieren. Die Erzeugung und Wartung von myelinisierten Axonen ist ein komplexer Prozess, und koordinierte molekulare Wechselwirkungen zwischen neuronalen, glialen (von Schwann-Zellen oder Oligodendrozyten) und extrazellulären Matrixproteinen. Die Bedeutung und die Anwendbarkeit dieses Protokolls ist, dass es ermöglicht die Manipulation von Proteinen in einem spezifischen Zel…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Australian National Health and Medical Research Council (NHMRC fellowship #454330 to JX, project grant #628761 to SM and APP1058647 to JX), Multiple Sclerosis Research Australia (MSRA #12070 to JX), the University of Melbourne Research Grant Support Scheme and Melbourne Research CI Fellowship to JX as well as Australia Postgraduate Scholarships to HP and AF. We would like to acknowledge the Operational Infrastructure Scheme of the Department of Innovation, Industry and Regional Development, Victoria Australia.
Materials
| Item | Manufacturer | Catalog # | Notes |
| 2K7 lentivector | Kind gift from Dr Suter9 | ||
| 5-Fluoro-2′-deoxyuridine | Sigma-Aldrich | F0503-100mg | |
| Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse IgG | Jackson Immunoresearch | 115545205 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Life Technologies | A11008 | |
| Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgG (H+L) | Life Technologies | A11005 | |
| Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Life Technologies | A11012 | |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A9518-5G | |
| B27 – NeuroCul SM1 Neuronal Supplement | Stem Cell Technologies | 5711 | |
| BDNF (Human) | Peprotech | PT450021000 | |
| Biotin (d-Biotin) | Sigma Aldrich | B4639 | |
| Bradford Reagent | Sigma Aldrich | B6916-500ML | |
| BSA | Sigma Aldrich | A4161 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378-100G | |
| CNTF | Peprotech | 450-13020 | |
| DAKO fluoresence mounting media | DAKO | S302380-2 | |
| DMEM, High Glucose, Pyruvate, no Glutamine | Life Technologies | 10313039 | |
| DNase | Sigma-Aldrich | D5025-375KU | |
| DPBS | Life Technologies | 14190250 | |
| DPBS, calcium, magnesium | Life Technologies | 14040182 | |
| EBSS | Life Technologies | 14155063 | |
| EcoRI-HF | NEB | R3101 | |
| Entry vectors for promoter and gene of interest | Generate as per protocols 1-2 | ||
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | 12003C | |
| Forskolin | Sigma Aldrich | F6886-50MG | |
| Glucose (D-glucose) | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| Glycerol | Chem Supply | GL010-500M | See stock solutions |
| Goat Anti-Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 115005003 | |
| Goat Anti-Mouse IgM | Jackson ImmunoResearch | 115005020 | |
| Goat Anti-Rat IgG | Jackson ImmunoResearch | 112005167 | |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | |
| Igepal | Sigma Aldrich | I3021-100ML | |
| Insulin | Sigma Aldrich | I6634 | |
| Kanamycin | Sigma-Aldrich | 60615 | |
| Laminin | Life Technologies | 23017015 | |
| LB Medium | See stock solutions | ||
| LB-Agar | See stock solutions | ||
| L-cysteine | Sigma-Aldrich | C-7477 | |
| Leibovitz's L-15 Medium | Life Technologies | 11415064 | |
| L-Glutamate | Sigma-Aldrich | G1626 | |
| L-Glutamine- 200mM (100X) liquid | Life Technologies | 25030081 | |
| LR Clonase II Plus enzyme | Life Technologies | 12538-120 | |
| MEM, NEAA, no Glutamine | Life Technologies | 10370088 | |
| Mouse α βIII Tubulin | Promega | G7121 | |
| Mouse αMBP (monoclonal) | Millipore | MAB381 | |
| Na pyruvate | Life Technologies | 11360-070 | |
| NAC | Sigma Aldrich | A8199 | |
| NcoI-HF | NEB | R3193S | |
| NEBuffer 4 | NEB | B7004S | |
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103049 | |
| NGF (mouse) | Alomone Labs | N-100 | |
| NT-3 | Peprotech | 450-03 | |
| O1 antibody – Mouse anti-O1 | Millipore | MAB344 | Alternative if O1 hybridoma cells are unavailable |
| O1 hybridoma cells | Conditioned medium containing anti-O1 antibody to be used for immunopanning | ||
| O4 antibody – Mouse anti-O4 | Millipore | MAB345 | Alternative if O4 hybridoma cells are unavailable |
| O4 hybridoma cells | Conditioned medium containing anti-O4 antibody to be used for immunopanning | ||
| Competent Cells | Life Technologies | A10460 | |
| One Shot Stbl competent cells | Life Technologies | C7373-03 | |
| Papain Suspension | Worthington/Cooper | LS003126 | |
| pBR8.91 | Kind gift from Dr Denham10 | ||
| PDGF-AA (Human) | Peprotech | PT10013A500 | |
| Penicillin- Streptomycin 100X solution | Life Technologies | 15140122 | |
| pENTRY4IRES2GFP | Invitrogen | 11818-010 | |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| Poly-D-lysine | Sigma | P6407-5MG | |
| Polyethylenimine (PEI) | Sigma-Aldrich | 408727-100ML | |
| Poly-L-ornithine | Sigma Aldrich | P3655 | |
| Progesterone | Sigma Aldrich | P8783 | |
| Protease inhibitor tablet (Complete mini) | Roche | 11836153001 | |
| Proteinase K | Supplied with Clonase enzyme | ||
| Putrescine | Sigma Aldrich | P-5780 | |
| Rabbit α neurofilament | Millipore | AB1987 | |
| Rabbit αMBP (polyclonal) | Millipore | AB980 | |
| Ran2 hybridoma cells | ATCC | TIB-119 | Conditioned medium containing anti-Ran2 antibody to be used for immunopanning |
| Rat anti CD140A/PDGFRa antibody | BD Pharmingen | 558774 | |
| SacII | NEB | R0157 | |
| SOC medium | Supplied with competent bacteria | ||
| Sodium selenite | Sigma Aldrich | S5261 | |
| Spe I | NEB | R0133S | |
| T4 DNA Ligase | NEB | M0202S | |
| T4 DNA Ligase Buffer | NEB | B0202S | |
| TE buffer pH8 | See stock solutions | ||
| TNE lysis buffer | |||
| Trace Elements B | Cellgro | 99-175-CI | |
| Transferrin (apo-Transferrin human) | Sigma-Aldrich | T1147 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T9201-1G | |
| Trypsin Inhibitor From Chicken Egg White | Roche | 10109878001 | |
| Trypsin-EDTA (1X), phenol red (0.05%) | Life Technologies | 25300-054 | |
| Unconjugated Griffonia Simplicifolia Lectin BSL-1 | Vector laboratories | L-1100 | |
| Uridine | Sigma-Aldrich | U3003-5G |
References
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