Détection glycogène dans les cellules mononucléaires du sang périphérique avec l'acide périodique Schiff coloration

Résumé

La coloration périodique à l’acide de Schiff est une technique qui permet de visualiser la teneur en polysaccharides des tissus. Cet article présente le protocole de coloration périodique à l’acide de Schiff adapté pour une utilisation sur des cellules mononucléées du sang périphérique purifiées à partir de sang veineux humain. Ces échantillons sont enrichis pour les lymphocytes et autres globules blancs du système immunitaire.

Résumé

La coloration périodique à l’acide de Schiff (PAS) est une technique immunohistochimique utilisée sur les biopsies musculaires et comme outil de diagnostic pour les échantillons de sang. Les polysaccharides tels que le glycogène, les glycoprotéines et les glycolipides colorent le magenta vif, ce qui facilite le dénombrement des cellules positives et négatives dans le tissu. Dans les cellules musculaires, la coloration PAS est utilisée pour déterminer la teneur en glycogène dans différents types de cellules musculaires, tandis que dans les échantillons de cellules sanguines, la coloration PAS a été explorée comme outil de diagnostic pour une variété de conditions. Le sang contient une proportion de globules blancs qui appartiennent au système immunitaire. L’idée que les cellules du système immunitaire possèdent du glycogène et l’utilisent comme source d’énergie n’a pas été largement explorée. Ici, nous décrivons une version adaptée du protocole de coloration PAS qui peut être appliquée sur des cellules immunitaires mononucléées du sang veineux humain. De petites cellules avec des granules positifs au PAS et des cellules plus grandes avec une coloration diffuse au PAS ont été observées. Le traitement des échantillons avec de l’amylase abroge ces motifs, confirmant la spécificité de la coloration. Une autre technique basée sur la digestion enzymatique a permis de confirmer la présence et la quantité de glycogène dans les échantillons. Ce protocole est utile pour les hématologues ou les immunologistes qui étudient la teneur en polysaccharides dans les lymphocytes dérivés du sang.

Introduction

L'acide périodique Schiff (PAS) est une technique de coloration immunohistochimique qui est largement utilisé dans la recherche et le diagnostic musculaire. Il est également utilisé comme outil de diagnostic dans des échantillons de sang. La technique fonctionne en appliquant une solution d'acide périodique à l'échantillon, qui se oxyde à l'intérieur des unités de polysaccharide créer des groupes aldéhyde qui réagissent avec le réactif de Schiff l'incolore pour produire ainsi un produit de magenta foncé. Les étapes de cette procédure sont représentées sur la figure 1. La tache tourne avec quoi que ce soit, y compris des polysaccharides magenta glycog....

Protocole

Recherche avec des échantillons de sang humain a été approuvé par le Conseil d'examen éthique de l'Université Concordia, le numéro de certificat 10000618. Le travail sur les muscles de la souris a été approuvé par le Conseil d'examen éthique de l'Université Concordia, numéro de certificat 2010BERG.

1. Isolement PBMC à partir de sang

REMARQUE: Effectuer cette procédure dans une enceinte de biosécurité utilisant une technique stérile et de l'équipement du fabricant stérilisé.

1. Verser soigneusement 10 à 15 ml de sang complet à partir des tubes héparinés (anti-coagulant) collecte de s....

Résultats

Pour valider les réactifs et la technique de base, PAS coloration a été effectuée selon les instructions du fabricant sur des sections du muscle soléaire de souris. La coloration a été réalisée le même jour que le sacrifice et dans la dernière étape de la coloration, les coupes ont été fixées par du xylène. Le muscle soléaire est connu pour contenir ~ 35% de cellules de glycogène positif ^9. Les cellules musculaires colorées affichent deux granulés ponctuées Caractéristiques- PAS-positifs distincts au sein de .......

Discussion

Les étapes essentielles du présent article vidéo étaient au cours du lavage et de l'amylase traitement des cellules. Alors que le lavage des lames, l'étape clé utilisait une bouteille de lavage compressible plastique et laisser couler l'eau doucement à travers l'échantillon sur la lame et ne visant pas directement sur les échantillons. Même la pression d'eau directe moindre causerait les cellules à venir de la lame. Une autre étape clé était d'utiliser la même diapositive pendant ± conditions d&#.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Kits de réactif acide périodique-Schiff	Sigma-Aldrich	395B	Porter à température ambiante avant utilisation. Les composants de ce kit sont toxiques et nocifs. Manipuler avec précaution.
α-Amylase provenant du pancréas porcin	Sigma-Aldrich	A3176
Microscope binoculaire	Carl Zeiss Microscopy	Axio Lab A0
Kits de dosage du glycogène	Sigma-Aldrich	MAK016
Ficoll-Paque PLUS	VWR, GE Healthcare	17-1440-02	Polymère synthétique non ionique de saccharose.
Centrifugeuse			Pour l'isolement des PBMC, des godets oscillants ont été utilisés.