Protocol voor het bestuderen van Uitsterven van geconditioneerde angst in Naturally Fietsen vrouwelijke ratten

Summary

Gonadal hormones such as estrogen modulate memory formation in a number of experimental paradigms including fear extinction memory. This protocol describes a set of methods for investigating the influence of gonadal hormones specifically during extinction in naturally cycling females, including estrous cycle monitoring and exogenous estrogen administration.

Abstract

Verval van geconditioneerde vrees is uitgebreid bestudeerd in mannelijke knaagdieren. Onlangs is er een toenemend aantal studies aangeeft dat neurale mechanismen voor bepaalde gedragstaken en respons gedragingen verschillend bij vrouwen en mannen zijn. Met behulp van vrouwen in het onderzoek studies kan een uitdaging vormen vanwege de variatie van geslachtshormonen tijdens hun loopsheid. Dit protocol beschrijft gevestigde procedures die nuttig zijn bij het onderzoek naar de rol van oestrogeen in angst uitsterven geheugen consolidatie in vrouwelijke ratten zijn. Fase van de loopsheid en exogene oestrogenen administratie voorafgaand aan het uitsterven training kan uitsterven recall 24 uur later te beïnvloeden. De vaginale zwabberen techniek voor estrous fase identificatie hier beschreven helpt onderzoek en behandeling van natuurlijk fietsen geslachtshormonen. Het gebruik van deze fundamentele knaagdiermodel kan een nadere afbakening van de mechanismen waarmee oestrogeen angst uitsterven geheugen kan moduleren invrouwtjes.

Introduction

Inherente sekseverschillen zijn in verschillende cognitieve gedrag en leren paradigma's waargenomen in zowel mensen als knaagdieren. Bijvoorbeeld, het is gemeld dat vrouwen over het algemeen sterker verbale en detail-oriented capaciteiten, terwijl mannen beter ruimtelijk inzicht ^1-3. Deze sekseverschillen kunnen zijn deels te wijten aan de invloed van geslachtshormonen. Hoge estradiol niveaus te verbeteren de prestaties op taken waarbij vrouwen beter zijn, maar verergeren prestaties op taken die mannen goed ^4-6 doen meestal. Hoewel dit bewijs is dwingend, de beperkte mogelijkheid om volledige controle experimentele omgevingen humane studies maakt het moeilijk om te bepalen of deze effecten op het gedrag specifiek kan worden toegeschreven aan hormonen. Dierstudies daarentegen zorgen voor een volledig gecontroleerde omstandigheden.

Hoewel de fundamentele neurale mechanismen van angst uitsterven zijn geïdentificeerd en zijn goed bestudeerd bij mannen, is het onduidelijk ofdeze systemen is hetzelfde bij vrouwen of hoe ze veranderen in de loopsheid. Angst conditionering en uitsterven worden veel gebruikt gedragsproblemen paradigma bij knaagdieren en mensen te onderzoeken die verband houden met angststoornissen te voeren. Aangezien vrouwen een hoger risico voor angststoornissen en hogere symptoomduur en ernst ^7-13, is het essentieel om vrouwen in deze studies omvatten. De ondervertegenwoordiging van vrouwen in dit onderzoek kan worden toegeschreven aan de uitdagingen van estrous fase monitoring en boekhouding voor de gedragseffecten van geslachtshormonen. Laboratoria die doen onderzoeken vrouwtjes in dit verband ontmoeting problemen die vaak niet gemeld of zijn niet in de methoden voor hun studie beschreven.

Opkomende bewijs bij knaagdieren suggereert dat sekseverschillen in angst uitsterven worden gemoduleerd door geslachtshormonen ^14-18. In angst conditionering worden dieren getraind te vrezen van een bepaalde stimulus. Na een aantal ongewapende presentaties vande stimulus, de dieren leren niet te vrezen dat de cue, een proces genaamd uitsterven. Hoe goed het dier leert en consolideert de herinnering aan het leren van deze taak tijdens een uitsterven recall-test gegeven enige tijd na het uitsterven training kan worden waargenomen. Minder angst expressie tijdens uitsterven recall demonstreert goede uitsterven geheugen consolidatie. Recente bevindingen uit ons laboratorium suggereren dat oestrogeen de consolidatie van angst uitsterven geheugen kan moduleren en te verbeteren uitsterven recall. Specifiek, vrouwelijke ratten die worden gedoofd in proestrus, de fase van de loopsheid waarin circulerende oestrogenen niveaus piek, vertonen verhoogde retentie van uitsterven geheugen. In tegenstelling, vrouwen die worden gedoofd in de lage-oestrogeen metestrus fase scherm relatief slechte uitsterven recall, die kan worden verbeterd met exogene estradiol administratie voorafgaand aan of direct na het uitsterven training ^15,16. De neurale mechanismen van uitsterven geheugen consolidatie (inclUding de rol van geslachtshormonen) bij vrouwen zijn niet duidelijk.

Bij proefdieren, kan de rol van hormonen worden onderzocht met behulp van invasieve chirurgische verwijdering procedures, zoals castratie en ovarectomie. Na het herstel van een operatie, geslachtshormonen worden vaak exogeen gemanipuleerd tijdens de uitvoering van een gedrags-taak ^19. Deze aanpak heeft cruciale informatie verstrekt over de geslachtshormonen en is nuttig omdat het zorgt voor een goed gecontroleerde manipulaties van geslachtshormonen (in termen van timing en dosering) ^20-23. Deze benadering is echter niet de invloed van de natuurlijk voorkomende schommelingen die zich voordoen in de loopsheid noch vormen zij "normale" dieren, zodat de translationele potentieel menselijke studies beperken beoordelen. Het is goed gedocumenteerd dat vrouwelijke geslachtshormoon niveaus piek en daling bij bepaalde fasen van de loopsheid, en oestrogeen receptor expressie veranderingen binnen de cyclus,en na ovariectomie ^24. Er is dus behoefte aan studies over vrouwen met intacte geslachtsklieren en verfijnen experimentele ontwerpen om op betrouwbare wijze de studie van de effecten die hoge en lage oestrogeen staten kunnen hebben op vrouwen gedurende hun levensduur.

Dit protocol is gericht op het effect van oestrogeen op de neurobiologische ook die angst uitsterven. Het beschrijft hoe u: 1) zorgvuldig toezien op de loopsheid, 2) bereidt effectieve doses van estradiol voor systemische toediening, en 3) volgen een gedrags-paradigma dat angst conditionering, uitsterven omvat, en op te roepen in natuurlijk fietsen vrouwelijke ratten. Dit protocol kan worden aangepast met andere farmacologische manipulaties en cellulaire en moleculaire tools waarmee studies helpen om beter te begrijpen sekseverschillen die worden waargenomen in geconditioneerde angst uitsterven gedrag. Merk op dat de hieronder beschreven procedures die gebruikt worden in ons laboratorium, en er bestaan ​​een aantal variaties van deze procedures in de literatuur.

Protocol

OPMERKING: Alle procedures in dit protocol zijn goedgekeurd door de Subcommissie Research Animal Care, die dient als de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) voor het Massachusetts General Hospital, en zijn in overeenstemming met de National Institutes of Health richtlijnen. 1. Dierlijke Huisvesting en Hanteringprocedure Bij aankomst, huis volwassen Sprague Dawley vrouwelijke ratten ongeveer 8-10 weken oud (met een gewicht van 200-225 g) in groepjes van 3-4 inch plas…

Representative Results

In deze angst uitsterven recall-protocol, werd procent vriespunt gemeten als een indicator van angst. Dieren die goed gedoofd en behield de herinnering aan het uitsterven training tentoongesteld lage angst op de laatste dag van de gedrags-testen tijdens uitsterven recall. Mannelijke en vrouwelijke ratten niet significant verschillen in geconditioneerde angst expressie tijdens de conditionering, uitsterven, en herinneren fasen (figuur 2). Echter, een sex verschil wordt duidelijk wanneer de dieren afzonde…

Discussion

Angst uitsterven is uitgebreid bestudeerd bij mannelijke ratten met de neurale mechanismen bemiddelen geconditioneerde angst uitsterven geïdentificeerd en beoordeeld op basis van diverse manipulaties. Relatief weinig studies hebben vrouwelijke ratten of de rol van geslachtshormonen in angst uitsterven onderzocht. Om specifiek bestuderen de effecten van oestrogeen op angst uitsterven, zijn natuurlijk fietsen vrouwelijke ratten onderworpen aan een driedaagse behavioral paradigma. Deze procedure bestaat uit gewenning / co…

Materials

Name	Company	Catalog number	Comments
Fear conditioning chamber	Coulbourn Instruments
Graphic State	Coulbourn Instruments
Sound-attenuating box	Med Associates, Inc.	NIR-022MD
Estradiol	Sigma-Aldrich	E1024	In sesame oil for subcutaneous injection
Sesame oil	Sigma-Aldrich	S3547-250ML
Freezescan	Cleversys, Inc.
Dip quick stain	Jorgensen Laboratories, Inc.	J0322A1, J0322A2, J0322A3
Cotton-tipped applicators	Fisher Scientific	23-400-114	6-inch, sterile
0.9% saline	LabChem, Inc.	LC23460-2	Sodium chloride w/v
Selectfrost microscope slides	Fisher Scientific	12-550-003
Virex II 256	Diversey, Inc.	5019317	Dilute 1:256 with water
Luer-Lok Tip 1ml Syringes	Becton Dickinson	309628
Hypodermic disposable needles	Exelint International, Co.	26402	26-gauge