ניתוח הספציפי של החלבון ליזין Methyltransferases שימוש SPOT פפטיד מערכים
Summary
Peptide arrays synthesized by the SPOT method can be used to analyze the substrate specificity of Protein lysine methyltransferases (PKMTs) and to define the substrate spectrum of PKMTs to understand their biological role. This protocol describes how to synthesize peptide arrays, methylate them with PKMTs, and analyze the results.
Abstract
מתילציה ליזין היא שינוי לאחר תרגום מתעורר וזה זוהה על חלבונים כמה היסטון ולא-היסטון, שבו היא משחקת תפקידים מכריעים בפיתוח תאים ומחלות רבות. כ -5,000 אתרי מתילציה ליזין זוהו על חלבונים שונים, הנקבעים על ידי כמה עשרות methyltransferases יזין החלבון. הדבר מצביע על כך כל PKMT methylates חלבונים מרובים, אך עד עכשיו רק אחד או שתיים מצעים זוהו במשך כמה אנזימים אלה. הספציפיות מצע מבוססות מערך פפטיד להתקרב בעיה זו, יש לנו הצגתי ניתוחים של PKMTs. מערכי פפטיד הם כלים רבי עוצמה כדי לאפיין את הספציפיות של PKMTs כי מתילציה של כמה מצעים עם רצפים שונים, ניתן לבדוק על מערך אחד. אנו מסונתזים מערכי פפטיד על קרום תאית באמצעות סינתיסייזר Intavis SPOT וניתחנו את הספציפיות של PKMTs השונים. בהתבסס על התוצאות, לכמה מאנזימים אלה של רומן,ubstrates יכול להיות מזוהה. לדוגמא, לNSD1 על ידי העסקת מערכי פפטיד, שהראינו כי זה methylates K44 של H4 במקום H4K20 דיווח ובנוסף H1.5K168 הוא המצע המועדף ביותר על H3K36 הידוע קודם לכן. לפיכך, מערכי פפטיד הם כלים רבי עוצמה כדי לאפיין ביוכימית PKMTs.
Introduction
בשני העשורים האחרונים, כמה דיווחים הוכיחו את החשיבות של שינויים לאחר translational (PTM) בפיתוח סלולארי וכמה מחלות כמו סרטן, אך לאחרונה מתילציה ליזין חלבון התפתחה אחר PTM חיוני. בעוד מתילציה ליזין תחילה היסטון נמצאה סימן הכרומטין חיוני, עבודה מאוחר יותר הראתה גם מתילציה ליזין של כמה חלבונים לא-היסטון 1-4. ההעברה רציפה של קבוצות מתיל מS-adenosyl-L-מתיונין לקבוצת ε-אמינו של שאריות ליזין היא זרז על ידי משפחה של אנזימים בשם החלבון Methyltransferases ליזין (PKMTs) המכילה יותר מ -60 חלבונים בגנום האנושי. PKMTs תחילה התגלה כאנזימי היסטון שינוי שmethylate שאריות ליזין ספציפיים אך דיווחים מאוחרים יותר הראו שהם יכולים גם methylate חלבונים לא-היסטון 5. עד עכשיו, כ -5,000 אתרי מתילציה ליזין זוהו על חלבונים שונים 6 </sעד>, אך האנזימים אחראים לשינויים אלה לעתים קרובות לא מזוהים. אחת סיבות לכך היא שהספציפיות של רוב PKMTs לא נחקרו בהרחבה. לכן, שוב ושוב מתרחש שמצעי רומן של PKMTs מתגלים. חוסר ידע מפורט של סגוליות המצע של PKMTs מעכב הבנה של התפקוד הביולוגי שלהם והתפקיד. כדי לחקור את הספציפיות של PKMT בפירוט, שיעורי מתילציה של מצעי פפטיד רבים שונות בחומצות אמינו אחת או כמה יש למדוד ולהשוות, אשר באופן אידיאלי מתבצע באמצעות מערכי פפטיד. בהתבסס על הפרופילים ספציפיים וכתוצאה מכך, מצעי פוטנציאל של PKMTs ניתן לזהות שניתן ללמוד עוד.
מערכי פפטיד נמצאים בשימוש נרחב בכלים לניתוח ביוכימי של נוגדנים, אנזימי שינוי פפטיד ומיפוי של אתרי אינטראקציה בין חלבונים (הנוגדנים אנטיגן, קולט ליגנד) 7-9. כמה מאות פפטידים הנדרשים לsucיישומי h. שיטות שונות זמינות עבור סינתזת פפטיד, ביניהם פפטיד סינתזה על שרף מאוד נפוץ, אבל יש לו מגבלות בתפוקה וזה יקר יחסית. בעיות אלה נפתרו עם כניסתה של שיטת סינתזת SPOT על ידי פרנק ועמיתים 10. שיטת סינתזת SPOT מאפשרת סינתזה של כמה מאה פפטידים במקביל ובממוצע זה הוא זול בהשוואה לסינתזת שרף. פפטידים המתאחד על קרום תאית יכולים לשמש באופן ישיר עבור יישומים או פפטידים שונים ניתן ביקעו מהקרום ומשמש כפפטידים חופשיים למבחני פתרון או להכין microarrays פפטיד 10-13.
סינתזת SPOT הינה נגזרת של סינתזת פפטיד השלב המוצקה, אשר עושה שימוש בקרום תאית כתמיכה מוצקה ומעסיקה Fmoc-הכימיה סטנדרטית 10-13. לפיכך, הסינתזה של רשתות פפטיד מתחילה בסוף C-מסוף וממשיך לכיווןסוף N-terminal בניגוד לסינתזה הביולוגית בריבוזומים. קרומים תאית הם פונקציונליות לצירופה של חומצות אמינו הופעלו הראשונות (איור. 1). שיטת SPOT מבוססת על האספקה רציפה של חומצות אמינו הופעלו בטיפה של ממס לכתמים מוגדרים על הקרום באמצעות מערכת pipetting אוטומטית. הטיפה של נוזל היא לוותר על הקרום הנקבובי שבו הוא יוצר כתם רטוב מעגלי, אשר מאוחר יותר פועל ככור פתוח לתגובות כימיות בסינתזת פפטיד. גודל הנקודה נקבע על ידי הנפח לוותר ויכולת הקליטה של הקרום, בכפולות של כתמים כגון מסודרות כמו מערכים. הסולם של סינתזה בקורלציה עם גודל הנקודה ואת יכולת הטעינה של הקרום. המרחק בין הכתמים והצפיפות של מערכים מנוהל על ידי שינוי גדלי המקום. יש קרום תאית כמה יתרונות כמו שלב מוצק בסינתזת פפטיד, זה לא יקר, סובלני לchemicals משמש בסינתזת פפטיד, יציב בתמיסות מימיות וקל לטפל. בנוסף, האופי הידרופילי שלה הופך אותו מתאים למספר מערכות assay ביולוגיות. סינתזת SPOT יכולה להתבצע באופן ידני או אוטומטי (ל1000s של פפטידים) בהתאם למספר הנדרש של פפטידים. סינתיסייזר SPOT אוטומטי לחלוטין מIntavis (קלן, גרמניה) משמש ליישומים שלנו. היא מאפשרת סינתזה של פפטידים בכמויות שונות ואורך שונה. פפטידים ליניארי מסונתזים באופן קבוע עם אורך חומצת אמינו 15 עד 20, בפפטידים תוספת של עד 42 חומצות אמינו יכול גם להיות מוכן בסינתזה צעד חכם 14,15. עם זאת, הגדלת מספר חומצות אמינו מובילה לירידה בתשואות הצימוד הכוללות, אשר משפיעה על האיכות של פפטידים. בגלל הכמות הנמוכה של פפטידים למקום, המוצרים לעתים קרובות קשים כדי לטהר ולא ניתן להעריך בקלות את האיכות של פפטידים בודדים. לכן, התוצאות שהתקבלו מpept SPOTמערכי IDE חייבים להיות מאושרים גם עם פפטידים המתאחדים בשיטות סטנדרטי בקנה מידה גדולה יותר, אשר יכול להיות מטוהרת ונותחו על פי סטנדרטים בסינתזת פפטיד או על ידי סינתזת החלבונים המכילים את רצפי הפפטיד הרצויים. ובכל זאת, מצאנו את סינתזת SPOT להיות אמין מאוד ותוצאות בדרך כלל להיות לשחזור. סינתזת SPOT אינה מוגבלת לproteinogenic חומצות אמינו, חומצות אמינו כמה שונה זמינות מסחרי יכול לשמש גם לסינתזה, המאפשרת פפטידים להיות שונה לפני ואחרי המחשוף הסופי של קבוצת הגנת צד שרשרת ו, יתר על כן, הוא גם מאפשר שילוב של חומצות אמינו phosphorylated, מפוגלים או acetylated 11.
ספריות פפטיד משותקות המסונתזת על ידי שיטת SPOT ניתן להשתמש ישירות עבור רבים מבחני ביולוגיים וביוכימיים. אנחנו עובדים מערכי פפטיד הכוללים 300-400 פפטידים לחקור את הספציפיות המצע של PKMTs. לmodifi האנזימטיתקטיון, מערכי פפטיד מודגרת עם PKMT המתאים ושכותרתו [methyl- 3 H] -AdoMet במאגר מתאים. מתילציה של המצע המתאים מנותחת על ידי בעקבות ההעברה האנזימטית של קבוצות מתיל שכותרת רדיואקטיבית מAdoMet למצע פפטיד באמצעות autoradiography (איור. 3). על ידי הליך זה, מערכי פפטיד לאפשר המחקר של מתילציה של מצעי פפטיד שונים באותו הזמן. יתרון חשוב של שיטה זו הוא שכל פפטידים מפוגלים בתחרות, כך שבשלב ליניארי של קינטיקה מתילציה, מתילציה היחסית של כל פפטיד היא פרופורציונלית לשיעור הקבוע קטליטי מחולק במתמיד דיסוציאציה (k חתול / K D) של האנזים למצע פפטיד בהתאמה. לפיכך, הסכום של רדיואקטיביות שולב כל נקודה מתואם ישירות עם הפעילות האנזימטית לקראת פפטיד המסוים. שימוש בתוצאותיו של ניסוי מתילציה מערך פפטיד, הפרופיל הספציפי של PKMT יכול להיות מוגדרת ומבוסס על מצעי הרומן הזה יכול להיות מבוסס. מערכי פפטיד לאפשר אימות היעילה המהירה ועלות של מתילציה של מצעי רומן ברמת פפטיד. לשם כך, מערכים מוכנים המכילים את מצעי הרומן חזו יחד עם פפטידים שונה המכילים עלא במקום ליס באתרי היעד, כמו גם פפטידים ביקורת חיוביים ושליליים. לבסוף, ניתן להכין מצעי רומן חלבונים יחד עם מוטציות, שבו היעד ליס משתנה לעלא ומתילציה ניתן לאשר ברמת החלבון. בהתאם לתוצאות, זה לאחר מכן על ידי מחקרים ביולוגיים טיפול תפקידים פוטנציאליים של מתילציה של מצעי החלבון תיארו זה עתה.
Protocol
Representative Results
Discussion
סינתזת SPOT כפי שמתואר כאן היא שיטה חזקה כדי למפות אתרי אינטראקציה בין חלבונים ולחקור את הכרת המצע של אנזימי פפטיד שינוי. עם זאת, סינתזת SPOT עדיין יש חסרונות מסוימים, משום שלמרות שפפטידים המתאחדים בשיטת SPOT מדווחים יש יותר מ- 90% טוהר 21 זה קשה כדי לאשר בכל מקרה. לכן, תו?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work has been supported by the DFG grant JE 252/7.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Ethanol abs Gradient Grade HPLC | Honeywell | 10299901 | Flammable |
| N,N-Dimethylformamide Peptide Synthesis | Biosolve | 4193302 | Flammable, Toxic |
| Piperidine ≥ 99 % for Peptide Synthesis | Roth | A122.1 | Flammable, Toxic, corrosive |
| Oxyma Pure (Ethyl (hydroxyimino)cyanoacetate ) | Novabiochem | 8510860100 | |
| N,N’-Diisopropylcarbodiimide purum ≥ 98% GC | Fluka | 38370 | Flammable, Toxic, corrosive |
| Acetic anhydride | Roth | CP28.1 | Flammable, Toxic, corrosive |
| Triisopropylsilane 99%, | Aldrich | 233781 | Flammable, Toxic |
| Dichlormethane ≥99,9% | Roth | P089.1 | Carcinogenic |
| N-Methyl-2-Pyrrolidone | Roth | 4306.2 | Toxic |
| Derivatized cellulose Membrane | Intavis AG Köln | 32.1 | |
| Trifluoroacetic acid | Roth | P088.2 | Toxic, corrosive |
| Bromphenolblue | AppliChem | A3640.0010 | |
| Ammonium Hydrogen Carbonate | Roth | T871.2 | Toxic |
| Sodium Dodecyl Sulfate Pellets | Roth | CN30.3 | Toxic, Flammable |
| MultiPep Synthesizer | Intavis AG Köln | n.a. | |
| HyperfilmTM high performance film | GE Healthcare | 28906837 | |
| Phoretix software | TotalLab | n.a. |
References
- Margueron, R., Reinberg, D. Chromatin structure and the inheritance of epigenetic information. Nat. Rev. Genet. 11, 285-296 (2010).
- Dawson, M. A., Kouzarides, T. Cancer epigenetics: from mechanism to therapy. Cell. 150, 12-27 (2012).
- Helin, K., Dhanak, D. Chromatin proteins and modifications as drug targets. Nature. 502, 480-488 (2013).
- Clarke, S. G. Protein methylation at the surface and buried deep: thinking outside the histone box. Trends in Biochemical Sciences. 38, 243-252 (2013).
- Rathert, P., et al. Protein lysine methyltransferase G9a acts on non-histone targets. Nature Chemical Biology. 4, 344-346 (2008).
- Hornbeck, P. V., Chabra, I., Kornhauser, J. M., Skrzypek, E., Zhang, B. PhosphoSite: A bioinformatics resource dedicated to physiological protein phosphorylation. Proteomics. 4, 1551-1561 (2004).
- Reineke, U., Volkmer-Engert, R., Schneider-Mergener, J. Applications of peptide arrays prepared by the SPOT-technology. Current Opinion in Biotechnology. 12, 59-64 (2001).
- Winkler, D. F., Andresen, H., Hilpert, K. SPOT synthesis as a tool to study protein-protein interactions. Methods Mol. Biol. 723, 105-127 (2011).
- Leung, G. C., Murphy, J. M., Briant, D., Sicheri, F. Characterization of kinase target phosphorylation consensus motifs using peptide SPOT arrays. Methods Mol. Biol. 570, 187-195 (2009).
- Frank, R. The SPOT-synthesis technique. Synthetic peptide arrays on membrane supports–principles and applications. Journal of immunological methods. 267, 13-26 (2002).
- Hilpert, K., Winkler, D. F., Hancock, R. E. Peptide arrays on cellulose support: SPOT synthesis, a time and cost efficient method for synthesis of large numbers of peptides in a parallel and addressable fashion. Nature protocols. 2, 1333-1349 (2007).
- Li, S. S., Wu, C. Using peptide array to identify binding motifs and interaction networks for modular domains. Methods Mol. Biol. 570, 67-76 (2009).
- Winkler, D. F., Hilpert, K., Brandt, O., Hancock, R. E. Synthesis of peptide arrays using SPOT-technology and the CelluSpots-method. Methods Mol. Biol. 570, 157-174 (2009).
- Toepert, F., et al. Combining SPOT synthesis and native peptide ligation to create large arrays of WW protein domains. Angew Chem. Int. Ed. Engl. 42, 1136-1140 (2003).
- Volkmer, R. Synthesis and application of peptide arrays: quo vadis SPOT technology. Chembiochem : a EuropeanJournal of Chemical Biology. 10, 1431-1442 (2009).
- Rathert, P., Zhang, X., Freund, C., Cheng, X., Jeltsch, A. Analysis of the substrate specificity of the Dim-5 histone lysine methyltransferase using peptide arrays. Chemistr., & biology. 15, 5-11 (2008).
- Kudithipudi, S., Dhayalan, A., Kebede, A. F., Jeltsch, A. The SET8 H4K20 protein lysine methyltransferase has a long recognition sequence covering seven amino acid residues. Biochimie. 94, 2212-2218 (2012).
- Dhayalan, A., Kudithipudi, S., Rathert, P., Jeltsch, A. Specificity analysis-based identification of new methylation targets of the SET7/9 protein lysine methyltransferase. Chemistr., & Biology. 18, 111-120 (2011).
- Kudithipudi, S., Lungu, C., Rathert, P., Happel, N., Jeltsch, A. Substrate specificity analysis and novel substrates of the protein lysine methyltransferase NSD1. Chemistr., & Biology. 21, 226-237 (2014).
- Obenauer, J. C., Cantley, L. C., Yaffe, M. B. Scansite 2.0: Proteome-wide prediction of cell signaling interactions using short sequence motifs. Nucleic Acids Research. 31, 3635-3641 (2003).
- Takahashi, M., Ueno, A., Mihara, H. Peptide design based on an antibody complementarity-determining region (CDR): construction of porphyrin-binding peptides and their affinity maturation by a combinatorial method. Chimie. 6, 3196-3203 (2000).
- Kramer, A., et al. Spot synthesis: observations and optimizations. J. Pept. Res. 54, 319-327 (1999).
- Stadler, V., et al. Combinatorial synthesis of peptide arrays with a laser printer. Angew Chem. Int. Ed. Engl. 47, 7132-7135 (2008).
- Schnack, C., Hengerer, B., Gillardon, F. Identification of novel substrates for Cdk5 and new targets for Cdk5 inhibitors using high-density protein microarrays. Proteomics. 8, 1980-1986 (2008).
- Mah, A. S., et al. Substrate specificity analysis of protein kinase complex Dbf2-Mob1 by peptide library and proteome array screening. BMC Biochemistry. 6, 22 (2005).
