SPOT Peptit Diziler Protein Lizin Methyltransferases Özgünlüğü Analizi
Summary
Peptide arrays synthesized by the SPOT method can be used to analyze the substrate specificity of Protein lysine methyltransferases (PKMTs) and to define the substrate spectrum of PKMTs to understand their biological role. This protocol describes how to synthesize peptide arrays, methylate them with PKMTs, and analyze the results.
Abstract
Lizin metilasyonu yükselen bir translasyon sonrası modifikasyon olup, hücre gelişimi ve bir çok hastalıkta önemli bir rol oynar burada bu, birkaç histon ve histon olmayan proteinleri üzerinde tespit edilmiştir. Yaklaşık 5.000 lisin metilasyon siteleri, protein lisin methyltransferases birkaç onlarca tarafından belirlenen farklı proteinler, tespit edilmiştir. Bu artık, sadece bir ya da iki alt-tabakalar, bu enzimlerin birkaç için tespit edilmiştir, ancak kadar her PKMT birden proteinleri metile işaret etmektedir. Bu sorunu yaklaşım, biz girmiştik peptit dizisi bazlı substrat özgüllüğü PKMTs analizleri. Peptid dizileri farklı dizi ile çeşitli substratların metilasyon bir dizi test edilebilir, çünkü PKMTs özgüllüğünü tanımlamak için güçlü araçlardır. Biz INTAVIS SPOT sentezleyici kullanılarak selüloz zarı üzerinde peptid dizileri sentezlenmiş ve çeşitli PKMTs özgüllüğünü analiz edilmiştir. Bu enzimlerin birçoğu için, sonuçlara göre, yeni substrates tanımlanabilir. Örneğin peptit dizileri kullanılarak NSD1 için, bunun H4 K44 yerine rapor H4K20 metile ve buna ek olarak H1.5K168 önceden bilinen H3K36 üzerinde yüksek ölçüde tercih edilen alt-tabaka olduğunu göstermiştir. Bu nedenle, peptid dizileri biyokimyasal PKMTs karakterize güçlü araçlardır.
Introduction
Son iki yılda, çeşitli raporlar hücresel gelişim ve kanser gibi çeşitli hastalıkların, ancak son zamanlarda protein lisin metilasyonu bir başka hayati PTM olarak ortaya çıkmıştır içinde post-translasyonel modifikasyonlar (PTM) önemini göstermiştir. Başlangıçta sübstrat olarak histon lizin metilasyon önemli bir kromatin işareti olarak bulunurken, daha sonra çalışmalar da çeşitli sivil histon proteinler 1-4 lizin metilasyon gösterdi. lizin kalıntılarının ε-amino grubunda ve S-adenosil-L-metionin metil gruplarının bir transferi insan genomunda 60 proteinleri içeren protein Lizin metiltransferaz (PKMTs) olarak adlandırılan bir enzim ailesi tarafından katalize edilmektedir. PKMTs başlangıçta belirli lizin kalıntısı metillenmesi ancak daha sonra raporlar da olmayan histon proteinler 5 metillenmesi olabilir gösterdi histon modifiye enzimler olarak tespit edildi. Şimdiye kadar, yaklaşık 5.000 lizin metilasyon siteleri farklı proteinler 6 tespit edildi </skadar>, ancak bu değişiklikler sorumlu enzimler genellikle tespit edilmez. Bunun bir nedeni, çoğu PKMTs özgünlüğü yoğun çalışılmamıştır olmasıdır. Bu nedenle, tekrar tekrar PKMTs yeni alt-tabakalar tespit edilmesi meydana gelir. PKMTs substrat seçiciliği detaylı bilgi eksikliği biyolojik fonksiyon ve rol anlayış engellemektedir. Ayrıntılı olarak PKMT özgünlüğünü incelemek için, bir veya birkaç amino asitin farklı bir çok peptit alt tabakasma metilasyonu oranları ölçülebilir olmalı ve ideal olarak peptid dizileri kullanılarak yapılır ki, karşılaştırıldı. Elde edilen özgüllük profilleri göre PKMTs potansiyel alt-tabakalar bundan başka incelenebilir olduğu tespit edilebilir.
Peptid dizileri yaygın olarak antikorlar, peptid değiştirici enzimler ve protein-protein etkileşim bölgeleri (antikor-antijen, reseptör-ligand), 7-9 haritalama biyokimyasal analizi için kullanılan araçlardır. Peptidlerin birkaç yüz suc için gerekli olanh uygulamaları. Farklı yöntemler onları çok yaygın olarak kullanılan bir reçine üzerinde sentez peptit arasında, peptid sentezi için kullanılabilir, ancak bu verim değeri sınırlıdır ve bu nispeten pahalıdır. Bu sorunlar Frank ve arkadaşları 10 tarafından SPOT sentez yöntemi tanıtımıyla çözüldü. SPOT sentez yöntemi paralel olarak birkaç yüz peptitlerin sentezini sağlar ve ortalama reçine sentezi göre ucuzdur. selüloz zarı üzerinde sentezlenen peptidler zar ayrılır ve çözelti deneylerinde serbest peptidler olarak kullanılabilir ya da peptid mikrodiziler 10-13 hazırlamak için edilebilir çeşitli uygulamalar veya peptidlere doğrudan kullanılabilir.
SPOT sentezi katı bir destek olarak bir selüloz zar kullanılır ve standart Fmoc kimyası kullanan 10-13 katı fazlı peptit sentezi, bir çeşididir. Bu nedenle, peptid zincirlerinin sentezlenmesi C-terminal ucunda başlar ve doğru ilerlerRibozomlar biyolojik sentezi aksine N-terminal ucu. Selüloz membranlar ilk olarak aktif amino asitler (Şek. 1) bağlanması için fonksiyonalize edilir. SPOT yöntem otomatik bir pipet sistemi kullanılarak zar üzerinde tanımlanan noktalar için çözücünün bir damlacık içinde aktive edilmiş bir amino asitlerin ardışık doğum dayanmaktadır. sıvı damlacık daha sonra peptit sentezinde kimyasal reaksiyonlar için açık bir reaktör olarak işlev yapan bir dairesel ıslak nokta oluşturur gözenekli zar üzerinde dağıtılır. spot büyüklüğü tevzi hacmi ve membran emme kapasitesi ile belirlenir, bu noktalar katları dizileri olarak düzenlenmiştir. sentez ölçekli nokta büyüklüğü ve membran yükleme kapasitesi ile ilişkilidir. noktalar ve dizilerin yoğunluğu arasındaki mesafe nokta boyutları değişen yönetilmektedir. Selüloz membran peptid sentezinde katı faz olarak bir çok avantajı vardır, bu kullanılan kimyasal için, ucuz toleranslıdırsulu çözeltiler içinde kararlı ve kolay olarak peptid sentezinde kullanılan als. Buna ek olarak, hidrofil bir karakter gösterir çeşitli biyolojik tahlil sistemleri için uygun yapar. SPOT Sentez elle gerçekleştirilir veya peptitler gerekli sayısına bağlı olarak, peptidler (1000'ler için) otomatik hale getirilebilir. INTAVIS (Köln, Almanya) Tam otomatik SPOT sentezleyici bizim uygulamalar için kullanılır. Farklı miktarlarda ve farklı uzunlukta peptit sentezini mümkün kılar. Ayrıca, adım adım sentezi 14,15 hazırlanabilir doğrusal peptidler düzenli 42 amino asidin eklenmesi peptitlerde, 15-20 amino asit uzunluğunda sentezlenir. Bununla birlikte, amino asit sayısının artması peptidlerin kalitesini etkiler genel birleştirme verimi, azalmalara yol açar. Çünkü nokta başına peptidler düşük bir miktarının bu ürünler genel olarak saflaştırılması zor olan ve ayrı ayrı peptitlerin ürünlerin kalitesi daha kolay değerlendirilemez. Bu nedenle, sonuçlar SPOT Pept eldeide dizileri saflaştırılmış ve peptid sentezinde veya arzu edilen peptid dizilerini ihtiva eden proteinlerin sentezlenmesi ile standartlara göre analiz edilebilir büyük ölçekli standart yöntemler ile sentezlenir peptidler ya onaylanmalıdır. Yine, biz son derece güvenilir olması için SPOT sentezini buldum ve tekrarlanabilir olması genellikle sonuçları. SPOT sentez olan peptidler daha önce ve bundan başka son yan zincir koruma grubunun yarılması ve sonra modifiye sağlayan, amino asitler, aynı zamanda sentezi için kullanılabilecek çeşitli ticari olarak temin edilebilen tadil edilmiş amino asitler, proteinojenik ile sınırlı değildir, aynı zamanda dahil edilmesini sağlar fosforile metillenmiş ya da asitile edilmiş amino asitler, 11.
SPOT yöntemi ile sentezlenmiş Hareketsizleştirilmiş peptit kolleksiyonları, çok sayıda biyolojik ve biyokimyasal analizler için de kullanılabilir. Bu PKMTs sübstrat spesifitesinin incelenmesi için 300-400 peptidleri içeren peptid dizileri kullanılabilir. Enzimatik modifi için, peptit dizileri, ilgili PKMT ile inkübe edilir ve uygun bir tampon maddesi içinde [metil- 3H] -AdoMet etiketli. ilgili alt-tabaka metilasyon otoradyografi ile peptid alt-tabakaya AdoMet gelen radyoaktif olarak etiketlenmiş metil grubu enzimatik transferi (Şek. 3) aşağıdaki şekilde analiz edilir. Bu prosedür ile, peptid dizileri, aynı zamanda, farklı peptit alt tabakasma metilasyonu çalışma sağlar. Bu yöntemin önemli bir avantajı, tüm peptidler metilasyon kinetiği doğrusal aşamasında, her bir peptidin nispi metilasyon ayrılma sabiti (k cat / K bölü katalitik hız sabiti ile orantılı olacak şekildedir, rekabet metillenmiş olmasıdır İlgili peptid maddesi için, enzim D). Bu nedenle, her bir nokta ile radyoaktivite miktarı, doğrudan belirli bir peptid karşı enzimatik aktivitesi ile ilişkilidir. Kullanmabir peptit dizisi metilasyon deneyin sonuçları, PKMT özgüllüğü profili teyit edilebilecektir, bu yeni yüzeylerde tanımlandığı gibidir ve dayalı olabilir. Peptit diziler peptid düzeyinde yeni yüzeylerde metilasyonu hızlı ve maliyet etkin doğrulama sağlar. Bunun için, dizi hedef bölgelerde yerine Lys Ala ihtiva eden modifiye edilmiş peptidler olarak pozitif ve negatif kontrol peptidleri ile birlikte tahmin edilen yeni alt tabakaların içeren hazırlanır. Son olarak, yeni alt-tabakalar bir araya mutantları ile protein, burada hedef Lys Ala ile değiştirilmiş olduğu ve metilasyon protein seviyesinde doğrulanabilir gibi hazırlanabilir. Sonuçlarına bağlı olarak, bu daha sonra yeni açıklanan protein maddelerinin metilasyonu potansiyel rolleri ele biyolojik çalışmalar takip edilmektedir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada tarif edildiği gibi SPOT sentezi, protein-protein etkileşimi sitesi harita ve peptit değiştirici enzim alt-tabaka tanıma araştırmak için güçlü bir yöntemdir. SPOT yöntemi ile sentezlenmiş peptitler, bu, her bir durumda teyit etmek zordur% 90'dan daha fazla saflığa 21 için rapor edilmiştir, ancak Ancak, SPOT sentezi, hala bazı dezavantajlara sahiptir. Bu nedenle, sonuçlar örneği kullanılarak protein etki ya da standart yöntemlerle sentezlenebilir saflaştırılmış peptidler…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work has been supported by the DFG grant JE 252/7.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Ethanol abs Gradient Grade HPLC | Honeywell | 10299901 | Flammable |
| N,N-Dimethylformamide Peptide Synthesis | Biosolve | 4193302 | Flammable, Toxic |
| Piperidine ≥ 99 % for Peptide Synthesis | Roth | A122.1 | Flammable, Toxic, corrosive |
| Oxyma Pure (Ethyl (hydroxyimino)cyanoacetate ) | Novabiochem | 8510860100 | |
| N,N’-Diisopropylcarbodiimide purum ≥ 98% GC | Fluka | 38370 | Flammable, Toxic, corrosive |
| Acetic anhydride | Roth | CP28.1 | Flammable, Toxic, corrosive |
| Triisopropylsilane 99%, | Aldrich | 233781 | Flammable, Toxic |
| Dichlormethane ≥99,9% | Roth | P089.1 | Carcinogenic |
| N-Methyl-2-Pyrrolidone | Roth | 4306.2 | Toxic |
| Derivatized cellulose Membrane | Intavis AG Köln | 32.1 | |
| Trifluoroacetic acid | Roth | P088.2 | Toxic, corrosive |
| Bromphenolblue | AppliChem | A3640.0010 | |
| Ammonium Hydrogen Carbonate | Roth | T871.2 | Toxic |
| Sodium Dodecyl Sulfate Pellets | Roth | CN30.3 | Toxic, Flammable |
| MultiPep Synthesizer | Intavis AG Köln | n.a. | |
| HyperfilmTM high performance film | GE Healthcare | 28906837 | |
| Phoretix software | TotalLab | n.a. |
References
- Margueron, R., Reinberg, D. Chromatin structure and the inheritance of epigenetic information. Nat. Rev. Genet. 11, 285-296 (2010).
- Dawson, M. A., Kouzarides, T. Cancer epigenetics: from mechanism to therapy. Cell. 150, 12-27 (2012).
- Helin, K., Dhanak, D. Chromatin proteins and modifications as drug targets. Nature. 502, 480-488 (2013).
- Clarke, S. G. Protein methylation at the surface and buried deep: thinking outside the histone box. Trends in Biochemical Sciences. 38, 243-252 (2013).
- Rathert, P., et al. Protein lysine methyltransferase G9a acts on non-histone targets. Nature Chemical Biology. 4, 344-346 (2008).
- Hornbeck, P. V., Chabra, I., Kornhauser, J. M., Skrzypek, E., Zhang, B. PhosphoSite: A bioinformatics resource dedicated to physiological protein phosphorylation. Proteomics. 4, 1551-1561 (2004).
- Reineke, U., Volkmer-Engert, R., Schneider-Mergener, J. Applications of peptide arrays prepared by the SPOT-technology. Current Opinion in Biotechnology. 12, 59-64 (2001).
- Winkler, D. F., Andresen, H., Hilpert, K. SPOT synthesis as a tool to study protein-protein interactions. Methods Mol. Biol. 723, 105-127 (2011).
- Leung, G. C., Murphy, J. M., Briant, D., Sicheri, F. Characterization of kinase target phosphorylation consensus motifs using peptide SPOT arrays. Methods Mol. Biol. 570, 187-195 (2009).
- Frank, R. The SPOT-synthesis technique. Synthetic peptide arrays on membrane supports–principles and applications. Journal of immunological methods. 267, 13-26 (2002).
- Hilpert, K., Winkler, D. F., Hancock, R. E. Peptide arrays on cellulose support: SPOT synthesis, a time and cost efficient method for synthesis of large numbers of peptides in a parallel and addressable fashion. Nature protocols. 2, 1333-1349 (2007).
- Li, S. S., Wu, C. Using peptide array to identify binding motifs and interaction networks for modular domains. Methods Mol. Biol. 570, 67-76 (2009).
- Winkler, D. F., Hilpert, K., Brandt, O., Hancock, R. E. Synthesis of peptide arrays using SPOT-technology and the CelluSpots-method. Methods Mol. Biol. 570, 157-174 (2009).
- Toepert, F., et al. Combining SPOT synthesis and native peptide ligation to create large arrays of WW protein domains. Angew Chem. Int. Ed. Engl. 42, 1136-1140 (2003).
- Volkmer, R. Synthesis and application of peptide arrays: quo vadis SPOT technology. Chembiochem : a EuropeanJournal of Chemical Biology. 10, 1431-1442 (2009).
- Rathert, P., Zhang, X., Freund, C., Cheng, X., Jeltsch, A. Analysis of the substrate specificity of the Dim-5 histone lysine methyltransferase using peptide arrays. Chemistr., & biology. 15, 5-11 (2008).
- Kudithipudi, S., Dhayalan, A., Kebede, A. F., Jeltsch, A. The SET8 H4K20 protein lysine methyltransferase has a long recognition sequence covering seven amino acid residues. Biochimie. 94, 2212-2218 (2012).
- Dhayalan, A., Kudithipudi, S., Rathert, P., Jeltsch, A. Specificity analysis-based identification of new methylation targets of the SET7/9 protein lysine methyltransferase. Chemistr., & Biology. 18, 111-120 (2011).
- Kudithipudi, S., Lungu, C., Rathert, P., Happel, N., Jeltsch, A. Substrate specificity analysis and novel substrates of the protein lysine methyltransferase NSD1. Chemistr., & Biology. 21, 226-237 (2014).
- Obenauer, J. C., Cantley, L. C., Yaffe, M. B. Scansite 2.0: Proteome-wide prediction of cell signaling interactions using short sequence motifs. Nucleic Acids Research. 31, 3635-3641 (2003).
- Takahashi, M., Ueno, A., Mihara, H. Peptide design based on an antibody complementarity-determining region (CDR): construction of porphyrin-binding peptides and their affinity maturation by a combinatorial method. Chimie. 6, 3196-3203 (2000).
- Kramer, A., et al. Spot synthesis: observations and optimizations. J. Pept. Res. 54, 319-327 (1999).
- Stadler, V., et al. Combinatorial synthesis of peptide arrays with a laser printer. Angew Chem. Int. Ed. Engl. 47, 7132-7135 (2008).
- Schnack, C., Hengerer, B., Gillardon, F. Identification of novel substrates for Cdk5 and new targets for Cdk5 inhibitors using high-density protein microarrays. Proteomics. 8, 1980-1986 (2008).
- Mah, A. S., et al. Substrate specificity analysis of protein kinase complex Dbf2-Mob1 by peptide library and proteome array screening. BMC Biochemistry. 6, 22 (2005).
