प्राथमिक Murine मस्तिष्क microvascular endothelial कोशिकाओं का अलगाव

Summary

Brain microvascular endothelial cells (BMEC) are interconnected by specific junctional proteins forming a highly regulated barrier separating blood and the central nervous system (CNS), the so-called blood-brain-barrier (BBB). The isolation of primary murine brain microvascular endothelial cells, as discussed in this protocol, enables detailed in vitro studies of the BBB.

Abstract

The blood-brain-barrier is ultrastructurally assembled by a monolayer of brain microvascular endothelial cells (BMEC) interconnected by a junctional complex of tight and adherens junctions. Together with other cell-types such as astrocytes or pericytes, they form the neurovascular unit (NVU), which specifically regulates the interchange of fluids, molecules and cells between the peripheral blood and the CNS. Through this complex and dynamic system BMECs are involved in various processes maintaining the homeostasis of the CNS. A dysfunction of the BBB is observed as an essential step in the pathogenesis of many severe CNS diseases. However, specific and targeted therapies are very limited, as the underlying mechanisms are still far from being understood.

Animal and in vitro models have been extensively used to gain in-depth understanding of complex physiological and pathophysiological processes. By reduction and simplification it is possible to focus the investigation on the subject of interest and to exclude a variety of confounding factors. However, comparability and transferability are also reduced in model systems, which have to be taken into account for evaluation. The most common animal models are based on mice, among other reasons, mainly due to the constantly increasing possibilities of methodology. In vitro studies of isolated murine BMECs might enable an in-depth analysis of their properties and of the blood-brain-barrier under physiological and pathophysiological conditions. Further insights into the complex mechanisms at the BBB potentially provide the basis for new therapeutic strategies.

This protocol describes a method to isolate primary murine microvascular endothelial cells by a sequence of physical and chemical purification steps. Special considerations for purity and cultivation of MBMECs as well as quality control, potential applications and limitations are discussed.

Introduction

अति विशिष्ट रक्त मस्तिष्क बाधा (बीबीबी) का एक अभिन्न हिस्सा हैं कि मस्तिष्क microvascular endothelial कोशिकाओं (BMEC) फार्म monolayers. BMECs एक तहखाने झिल्ली से जुड़ी junctional प्रोटीन से जुड़े रहते हैं. साथ में pericytes, चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं, astrocytic अंत पैर और घूम रक्त कोशिकाओं के साथ वे तथाकथित neurovascular इकाई (NVU) ¹ का निर्माण. रक्त और केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) के बीच एक अभेद्य अवरोध के पिछले धारणा के खिलाफ, NVU मस्तिष्क रक्त वाहिकाओं और सीएनएस ² के बीच तरल पदार्थ, अणुओं और कोशिकाओं के संक्रमण को नियंत्रित करता है कि एक गतिशील, अत्यधिक विशिष्ट और विनियमित इंटरफ़ेस है . NVU की शिथिलता या अनियंत्रण आरंभ और / या ऐसे इस्कीमिक स्ट्रोक, एचआईवी-मस्तिष्क विकृति, एकाधिक काठिन्य, अल्जाइमर या पार्किंसंस रोग ^3-6 रूप सीएनएस के neurovascular, संक्रामक भड़काऊ या अपक्षयी रोगों की एक किस्म के लिए योगदान कर सकते हैं.

_content "> BMEC monolayer कसकर तंग (टी जे) का गठन किया एक junctional जटिल से बंद है और (ए जे) ^7. उच्च विद्युत प्रतिरोध और बीबीबी की कम paracellular पारगम्यता मुख्य रूप से टी जे प्रोटीन पर आधारित हैं जंक्शनों ^8. TJS हैं adherens ऐसे zonulaoccludens (Zo) प्रोटीन के रूप में अनुकूलक अणुओं से endothelial कोशिकाओं की cytoskeleton से जुड़े होते हैं जो claudin और occludin परिवार की transmembrane प्रोटीन, द्वारा गठित परिसरों ZO1-3 ⁴ Adherens जंक्शनों मुख्य रूप से अभिन्न झिल्ली प्रोटीन द्वारा इकट्ठा कर रहे हैं. catenins ⁸ के माध्यम से cytoskeleton से जुड़ा हुआ है जो संवहनी endothelial (VE) -cadherin,.

बीबीबी की तंग सील रक्त और सीएसएफ के बीच substrates और कोशिकाओं के मुक्त आदान प्रदान से बचाता है. इस नियम के अपवाद लिपिड की मध्यस्थता प्रसार ⁹ से बीबीबी पार करने में सक्षम हैं जो एक आणविक वजन <400 दा साथ lipophilic, छोटे अणुओं, कर रहे हैं. बीतने बड़ा और / याऐसे ग्लूकोज, अमीनो एसिड, पेप्टाइड्स, प्रोटीन और कई दवाओं के रूप में हाइड्रोफिलिक अणुओं, पांच मुख्य श्रेणियों में वर्गीकृत किया जा सकता है जो अत्यधिक नियंत्रित transcellular परिवहन व्यवस्था ^10, तक ही सीमित है: वाहक की मध्यस्थता परिवहन, आयन परिवहन, सक्रिय तपका परिवहन, रिसेप्टर मध्यस्थता परिवहन, और caveolae की मध्यस्थता परिवहन ^4. ये ट्रांसपोर्टर सिस्टम एक सटीक संकेत पीढ़ी, पारगमन और एकीकरण के लिए आवश्यक है जो सीएनएस, की समस्थिति को बनाए रखने में मदद. इसके अलावा, BMECs सक्रिय रूप ectoenzymes की एक किस्म की अभिव्यक्ति से अलग अणुओं के संक्रमण को नियंत्रित करने में सक्षम हैं. ये एंजाइम निरोधक या बीबीबी ¹¹ के संक्रमण की अनुमति विशिष्ट अंतर्जात और exogenous substrates के कोशिका की सतह पर स्थानीय और संशोधित कर रहे हैं.

सीएनएस एक लंबे समय के लिए एक प्रतिरक्षा कमजोर अंग के रूप में माना जाता था, जबकि हाल के निष्कर्षों प्रतिरक्षा surv के बजाय एक गतिशील और कसकर विनियमित प्रणाली का सुझावसीएनएस के eillance. BMECs समीक्षकों प्रतिरक्षा सेल स्थानांतरगमन के नियमन में भी शामिल रहे हैं. उनकी सतह लिम्फोसाइटों पर selectins की अभिव्यक्ति द्वारा चुनिंदा शिथिल अन्तःचूचुक को संलग्न करने के लिए प्रेरित कर रहे हैं. ल्यूकोसाइट्स पर विशिष्ट रिसेप्टर्स के साथ मुठभेड़ कि chemokines के स्राव अभिव्यक्ति या ऐसे LFA-1 के रूप में ल्युकोसैट इंटेग्रिन के गठनात्मक परिवर्तन की ओर जाता है (लिम्फोसाइट समारोह जुड़े प्रतिजन-1) और VLA-4 (बहुत देर प्रतिजन-4). इंटेग्रिन के बीच या बीबीबी ^12-14 की BMECs के माध्यम से मस्तिष्क पैरेन्काइमा में स्थानांतरगमन सक्रिय करने के उनके एन्दोथेलिअल counterreceptors, जैसे Vcam-मैं (नाड़ी कोशिका आसंजन अणु), ICAM-मैं (कहनेवाला आसंजन अणु) बंधन से एक फर्म आसंजन मध्यस्थता. इन और अन्य निष्कर्षों प्रतिरक्षा सेल प्रवास को विनियमित करने में अन्तःचूचुक खुद की सक्रिय भूमिका रेखांकित करते हैं.

इसके अलावा, BMECs NVU का हिस्सा मस्तिष्क रक्त प्रवाह ली के नियमन में भी शामिल रहे हैंस्थानीय न्यूरोनल चयापचय मांगों को nked. Astrocytic उत्तेजना पर endothelial कोशिकाओं ऐसे संवहनी चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं ¹⁵ के विश्राम के लिए अग्रणी नाइट्रिक ऑक्साइड के रूप में vasoactive पदार्थों का उत्पादन.

विकास में और साथ ही वयस्क मस्तिष्क शो समानांतर patterning और विकास में और विनियमन ^{1, 4} के कई गुण साझा angiogenesis और न्यूरोजेनेसिस. Endothelial कोशिकाओं गंभीर रूप से इन प्रक्रियाओं को ^{16, 17} में शामिल हैं.

संक्षेप में, BMECs सीएनएस के समुचित विकास और कामकाज वारंट के लिए आवश्यक सुविधाओं को उपलब्ध कराते हैं. बीबीबी रोग कई गंभीर तंत्रिका संबंधी विकार से जुड़ा हुआ है. हालांकि, केवल बहुत कुछ लक्ष्यों को एक विशिष्ट और कुशल उपचार ¹⁸ के लिए मस्तिष्क vasculature के इंटरफेस में पहचान की गई है. इन विट्रो मॉडल में सरलीकृत एक लो के लिए समारोह और जटिल शारीरिक प्रणालियों के नियमन में शामिल तंत्र को समझने के लिए इस्तेमाल किया गया हैएनजी समय. , इस पांडुलिपि और murine BMECs की इन विट्रो अध्ययन द्वारा वर्णित विशिष्ट माउस पीटकर-स्ट्रेन की व्यापक विविधता को देखते हुए के रूप में अलगाव, नई चिकित्सकीय रास्ते खोलने शारीरिक और pathophysiological शर्तों के तहत बीबीबी समारोह और विनियमन की एक और समझ प्रदान हो सकता है.

Protocol

पशु संरक्षण के जर्मन कानून के अनुसार और आयोजित सभी पशु प्रयोगों स्थानीय अधिकारियों ("Recklinghausen, जर्मनी; Fachbereich 87, Tiergesundheit, Tierschutz LandesamtfürNatur, Umwelt अंड Verbraucherschutz NRW") द्वारा अनुमोदित किया गया. माउस प्रयोगों के लिए 1. जनरल टिप्पणियाँ संबंधित संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति के दिशा निर्देशों के अनुसार चूहों का उपयोग करके सभी प्रयोगों प्रदर्शन. रोगाणु मुक्त परिस्थितियों में चूहों रखें और भोजन और पानी यथेच्छ के लिए उपयोग करने के लिए उन्हें सक्षम. जैविक गुणों उम्र और लिंग के साथ भिन्न हो सकते हैं, क्योंकि प्रयोगात्मक समूहों में उम्र और लिंग-मिलान चूहों का प्रयोग करें. जब भी संभव हो, कम निखारने या पशु प्रयोगों को बदलने के लिए प्रयास करें. Percoll ढाल के 2. तैयारी 1 मिलीलीटर 10x पीबीएस, 1 मिलीलीटर एफसीएस और 10 मिलीलीटर Percoll साथ 1x पीबीएस के 19 मिलीलीटर मिलाएं. काएं प्रदर्शनएक ग्लास ट्यूब में निस्पंदन (: 0.2 माइक्रोन फिल्टर pores के व्यास) चिढ़ाना. बाद में 4 डिग्री सेल्सियस पर समाधान की दुकान. अन्तःस्तर सेल मध्यम और सेल संस्कृति प्लेटों की कोटिंग 3. तैयारी Endothelial सेल मध्यम: 500 मिलीलीटर माध्यम की तैयारी: (. लगभग 20%) 100 मिलीलीटर सार्वजनिक वितरण प्रणाली के साथ 400 मिलीलीटर DMEM मध्यम (. लगभग 80%) मिक्स, 0.25 मिलीलीटर bFGF (. 20 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल, लगभग 0.05%), 0.5 मिलीग्राम हेपरिन (100 μl / मिलीलीटर;. लगभग 0.1%) और 0.5 मिलीलीटर pyrumycin (4 मिलीग्राम / एमएल;. लगभग 0.1%). केवल संस्कृति के पहले 2 दिन में इस्तेमाल सेल संस्कृति माध्यम के लिए pyrumycin जोड़ें. एक ग्लास ट्यूब में बाँझ निस्पंदन (: 0.2 माइक्रोन फिल्टर pores के व्यास) प्रदर्शन. बाद में 4 डिग्री सेल्सियस पर समाधान की दुकान. सेल संस्कृति प्लेटों की कोटिंग: कोटिंग समाधान के 1 मिलीलीटर के लिए, 500 μl DDH 2 हे, 400 μl कोलेजन चतुर्थ (0.4 मिलीग्राम / एमएल) और 100 μl फ़ाइब्रोनेक्टिन (0.1 मिलीग्राम / एमएल) की एक समाधान तैयार है. पूर्वी वायु कमान की पूरी सतह को कवरकोटिंग समाधान के साथ सेल संस्कृति प्लेट की ज अच्छी तरह से. रातोंरात 4 डिग्री सेल्सियस पर थाली स्टोर. Murine मस्तिष्क microvascular endothelial कोशिकाओं के 4. अलगाव (MBMEC) ग्रीवा अव्यवस्था से – (12 सप्ताह पुरानी, ​​C57BL 6/8) 10 वयस्क चूहों बलिदान. बाद में पीबीएस के 5 मिलीलीटर में माउस-दिमाग और दुकान को अलग (चेतावनी: कार्य बाँझ). एक संदंश के साथ मस्तिष्क उपजा है, cerebella और Thalami निकालें. ध्यान से एक बाँझ सोख्ता कागज पर दिमाग रोलिंग द्वारा तानिका अलग करें. परिणामस्वरूप तानिका मुक्त forebrains लीजिए. DMEM के 13.5 मिलीलीटर से भरा एक 50 एमएल फाल्कन ट्यूब दिमाग स्थानांतरण. मीडिया दूधिया हो जाता है जब तक एक 10 मिलीलीटर विंदुक के साथ तो, पहले एक 25 मिलीलीटर विंदुक के साथ, ऊतक कीमा. फिर एक कक्षीय पर 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) में 0.6 मिलीलीटर collagenase CLS2 (10 मिलीग्राम / DMEM में एमएल) और 0.2 मिलीलीटर DNase (पीबीएस में 1 मिलीग्राम / एमएल) के मिश्रण के साथ ऊतक को पचाने मंथन180 rpm पर आर. DMEM के जोड़ें 10 मिलीलीटर 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 1000 XG पर ऊतक निलंबन और अपकेंद्रित्र कोशिकाओं गयी. सतह पर तैरनेवाला त्यागें (चेतावनी: गोली खो आसान है) 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 1000 XG पर (लगभग. 25 बार) (20 वी / डब्ल्यू%), और अपकेंद्रित्र, माइलिन हटाने बीएसए-DMEM के 25 एमएल में एक 25 मिलीलीटर विंदुक के साथ गोली resuspend. बड़ा व्यास के साथ एक टूटी हुई कांच पाश्चर विंदुक के साथ ऊपरी माइलिन परत (दूधिया) त्यागें, और फिर एक सामान्य पाश्चर विंदुक के साथ बीएसए परत त्यागें. 9 मिलीलीटर DMEM में गोली Resuspend और 1 मिलीलीटर collagenase / dispase और 0.1 मिलीलीटर DNase (अंतिम एकाग्रता 1 मिलीग्राम / एमएल है) जोड़ने. 180 rpm पर एक कक्षीय प्रकार के बरतन पर 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए समाधान डाइजेस्ट (चेतावनी: resuspend को पिपेट का उपयोग नहीं करते – कोशिकाओं को खो दिया जा सकता है). पाचन के दौरान, त्वरण, वाई के साथ, 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए 3000 XG पर एक ultracentrifuge का उपयोग घनत्व ढाल स्थापित करने के लिए Percoll समाधान अपकेंद्रित्रthout ब्रेक. पचा सेल निलंबन को DMEM के 10 मिलीलीटर जोड़ें. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 1000 XG पर निलंबन अपकेंद्रित्र. फिर सतह पर तैरनेवाला त्यागें और DMEM के 2 मिलीलीटर में गोली resuspend. त्वरण और ब्रेक के बिना 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 700 XG पर Percoll ढाल और अपकेंद्रित्र के शीर्ष पर ध्यान से resuspended कोशिकाओं जोड़ें. नोट: कोशिकाओं interphase में एक बादल के रूप में दिखाई दे रहे हैं. लगभग लो. एक लंबे बाँझ सुई के साथ कोशिकाओं के साथ interphase के 12 मिलीग्राम और DMEM के 5 मिलीलीटर के साथ एक नया 50 एमएल फाल्कन में जगह है. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 1000 XG पर फिर कोशिकाओं अपकेंद्रित्र. बाद में endothelial सेल मध्यम में गोली resuspend (लगभग उपयोग करें. माध्यम की 0.2 मिलीलीटर 1 सेमी सेल संस्कृति थाली के 2 सतह प्रति). लेपित सेल संस्कृति प्लेटों से कोटिंग समाधान निकालें (3.2 कदम देखें) और लगातार दो वाशिंग चरणों में बाँझ पीबीएस के साथ अच्छी तरह से हर कुल्ला. एन्दोथेलिअल में सेल संस्कृतियों का रखरखावसेल 37 डिग्री सेल्सियस पर मध्यम और 5% एक बाँझ इनक्यूबेटर में सीओ 2. हर दो से तीन दिन मध्यम बदलें. 90% संगम में विभाजित कोशिकाओं.

Representative Results

इसके तत्काल बाद अलगाव के बाद, murine BMECs और contaminating कोशिकाओं सेल संस्कृति माध्यम (चित्रा 1 ए, दिन 0) में चल कंपनियों के संगठन के रूप में. वे इस तरह के विषाक्त पदार्थों को एक रिश्तेदार प्रतिरोध के लिए अग्रणी पी-ग्लाइकोप्रोटीन के रूप में तपका ट्रांसपोर्टरों के उच्च स्तर व्यक्त बाद pyrumycin साथ उपचार murine BMECs का चयन होता है. Contaminating कोशिकाओं की मध्यस्थता cytotoxicity 19 pyrumycin करने के लिए और अधिक जल्दी हो जाता है. MBMECs कोलेजन चतुर्थ / फ़ाइब्रोनेक्टिन लेपित सेल संस्कृति प्लेट (चित्रा 1 ए, दिन 1 और 2 दिन) को संलग्न करने के लिए शुरू जबकि pyrumicin चयन की प्रक्रिया के दौरान, contaminating कोशिकाओं, apoptotic या परिगलित कोशिका मृत्यु दर्ज करें. 5 दिन तक, MBMECs लगभग एक घनत्व को पैदा करना. 80-90%. वे ठेठ धुरी के आकार उपस्थिति की विशेषता है. संगम पर वे कसकर अनुलंबीय गठबंधन, पैक और गैर अतिव्यापी संपर्क-हिचकते कोशिकाओं (चित्रा 1 ए, दिन 5) की एक monolayer के रूप में. से(; चित्रा 1 बी PECAM1) endothelial सेल मार्कर CD31 द्वारा प्रदर्शन के रूप में pyrumicin चयन, ऊपर 99% करने के लिए MBMEC के एक उच्च शुद्धता पर पहुंच गया है. MBMECs कसकर तंग जंक्शन प्रोटीन से जुड़े सील monolayers के रूप में. 7 – संस्कृति के 8 दिन, endothelial सेल परतों विद्युत प्रतिरोध के लिए स्थिर मूल्यों का निर्माण (20 के बीच विशिष्ट मूल्यों तक पहुँचने – Ω 30 एक्स 2 सेमी). और समाई (चित्रा 1C) इस समय बिंदु पर कार्यात्मक assays के इस तरह के सेल के रूप में इवांस नीले या dextran के साथ जैसे माइग्रेशन प्रयोगों 3, 20,21 और पारगम्यता परीक्षण, प्रदर्शन किया जाना चाहिए. चित्रा 1. आकृति-मूलक और murine BMECs के कार्यात्मक संपत्तियों. ट्रांसमिशन प्रकाश सूक्ष्म से देखा सुसंस्कृत BMECs की (ए) प्रतिनिधि समय पाठ्यक्रम5 दिनों scopy. स्केल बार सभी छवियों के लिए लागू होता है. Endothelial सेल मार्कर CD31 के लिए (बी) immunofluorescence धुंधला दिन 5. CD31 (हरा) और DAPI (नीला) में. (सी) कोशिकाओं 5 दिनों के लिए precultured और उसके बाद के लिए एक स्वचालित प्रणाली को हस्तांतरित किया गया biophysical गुण (प्रतिरोध और समाई) का विश्लेषण. यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Discussion

रक्त मस्तिष्क बाधा रोग एकाधिक काठिन्य में बीबीबी की जैसे एक टूटने बड़े पैमाने पर autoreactive प्रतिरक्षा कोशिकाओं द्वारा सीएनएस आक्रमण की सुविधा और oligodendrocytes की मुठभेड़ और विनाश के लिए सक्षम बनाता विभिन्न हानिकारक सीएनएस रोगों की एक बानगी है. इस्कीमिक स्ट्रोक में BBB के विघटन और मस्तिष्क edema के बाद गठन माध्यमिक रोधगलितांश विकास और रोगियों ⁶ के समग्र अस्तित्व को प्रभावित करने वाले महत्वपूर्ण कारक हैं. इसके अलावा, दूरदराज के क्षेत्रों में BBB के परिवर्तन द्वारा फोकल इस्कीमिक घावों मस्तिष्क के व्यापक कार्यात्मक परिवर्तन के लिए प्रेरित करने में सक्षम हैं. हालांकि, अंतर्निहित आणविक तंत्र ⁵ बड़े पैमाने पर अज्ञात हैं. इसके विपरीत, कार्यात्मक BMECs में उच्च घनत्व और तपका ट्रांसपोर्टरों की विविधता ऐसी संक्रामक रोगों के लिए मस्तिष्क कैंसर या एंटीबायोटिक दवाओं के लिए केमोथेरापी रूप से लाभप्रद दवाओं की एकाग्रता कम कर देता है. इसलिए, रक्त-मस्तिष्क-बार की एक गहरी समझशारीरिक और pathophysiological शर्तों के तहत rier समारोह में विशेष रूप से इष्ट दिशा ²¹ में बाधा समारोह को विनियमित करने में सक्षम हैं कि औषधीय एजेंटों को विकसित करने के लिए आवश्यक है. BBB के इन विट्रो मॉडल में विश्वसनीय बीबीबी पर नियामक तंत्र का अध्ययन करने के लिए अपरिहार्य औजार हैं.

कई अमर मस्तिष्क endothelial सेल लाइनों की स्थापना की और इन विट्रो बीबीबी मॉडल ²² के रूप में नियोजित किया गया है. वे तेजी से बढ़ने और कई मार्ग पर कुछ बीबीबी विशेषताओं रखने के रूप में इन सेल लाइनों प्राथमिक BMECs पर कुछ लाभ प्रदान करते हैं. हालांकि, endothelial सेल लाइनों को पूरी तरह से इन विवो स्थिति को प्रयोगात्मक निष्कर्षों की transferability साथ मिलाना कि जैसे महत्वपूर्ण गुण बदल रहे प्राथमिक कोशिकाओं के लिए विकल्प नहीं हो सकता. उदाहरण के लिए, murine मस्तिष्क endothelial सेल लाइन bEnd.5 उच्च parac के लिए अग्रणी discontinuously वितरित तंग जंक्शन प्रोटीन की ही निम्न स्तर व्यक्तellular पारगम्यता ^23. BEnd.3, एक और अक्सर इस्तेमाल murine मस्तिष्क endothelial सेल लाइन, घने और निरंतर वितरित तंग जंक्शनों, एक उच्च transendothelial प्रतिरोध, कई तपका ट्रांसपोर्टरों और कम paracellular पारगम्यता को दर्शाता है. प्राथमिक BMECs कुछ transcellular और paracellular substrates के ²⁴ के पारगमन के संबंध में एक असली भेदभाव की कमी करने के लिए हालांकि, bEND.3 सेल परतों की तुलना में.

प्राथमिक सेल संस्कृतियों की तैयारी में, contaminating कोशिकाओं काफी प्रयोगात्मक निष्कर्षों की वैधता के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं. Endothelial कोशिकाओं उच्च शुद्धता को प्राप्त करने के लिए वर्णित प्रोटोकॉल में, pyrumicin एक चयनात्मक एजेंट के रूप में प्रयोग किया जाता है. फिर भी, सेल संस्कृति का एक नियमित गुणवत्ता नियंत्रण अनिवार्य रूप से विश्वसनीय प्रयोगों के लिए सुनिश्चित करने की जरूरत है. Endothelial कोशिकाओं की खासियत रूपात्मक गुण (चित्रा 1 ए देखें), transendothelia अलावा गुणवत्ता नियंत्रण के लिए कई तरीके हैंएल प्रतिरोध मापा जा सकता है या ऐसे CD31 के रूप में endothelial सेल मार्कर की अभिव्यक्ति (चित्रा 1 बी देखें) या वॉन Willebrand कारक (vWF) का मूल्यांकन किया जा सकता है.

एक माउस मस्तिष्क से अलग मस्तिष्क endothelial कोशिकाओं की संख्या अपेक्षाकृत कम है और कई प्रयोगों के लिए एक उचित सेल संस्कृति स्थापित करने के लिए है, कई चूहों के दिमाग जमा किया जाना है. हमारे अनुभव में, कम से कम 10 चूहों संबंधित जानवर सुविधा के संसाधनों के आधार पर एक सीमित कारक हो सकता है जो एक प्रयोग के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए. पूर्वाग्रह या कारकों से बचने के क्रम में, एक समान आनुवांशिक और पर्यावरणीय पृष्ठभूमि के साथ ही चूहों जमा किया जाना चाहिए. इसके विपरीत, गोजातीय और सुअर का मस्तिष्क endothelial सेल तैयारी एक मस्तिष्क में उपलब्ध मस्तिष्क endothelial कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या प्रदान करते हैं. हालांकि, सीधी प्रजनन और आवास उपलब्ध ट्रांसजेनिक चूहों की व्यापक और बढ़ती प्रदर्शनों की सूची के अलावा प्राथमिक murine BMECs एक आदर्श के रूप में rendersमॉडल रक्त मस्तिष्क बाधा समारोह का अध्ययन करने के लिए.

बीबीबी और अंतर्निहित आणविक तंत्र के कार्यों के विषय में कई महत्वपूर्ण निष्कर्ष 2D टिशू कल्चर सिस्टम में पढ़ाई से आए हैं. हाल ही में, 3 डी संस्कृति प्रणाली endothelial कोशिकाओं लुमेन और ट्यूबलर नेटवर्क बनाने के लिए उन्हें सक्रिय करने के एक मैट्रिक्स कोलेजन के भीतर रखा जाता है जहां ^25, विकसित किया गया है. इन नए सेल संस्कृति सिस्टम विवो में बरकरार जीव में संवहनी प्रक्रियाओं का एक और भी अधिक सटीक प्रजनन के लिए अनुमति देते हैं. ऐसे pericytes और astrocytes के रूप NVU 3 डी में सेल संस्कृति प्रणालियों के आगे कोशिकाओं की भागीदारी रक्त मस्तिष्क बाधा समारोह का अध्ययन करने के लिए इन विट्रो में क्रांतिकारी बदलाव हो सकता है; पहला मॉडल ने हाल ही में ²⁶ विकसित किया गया है.

समस्या निवारण के लिए कुछ सिफारिशें की हैं. सभी बाँझ काम करने के पहले endothelial सेल संस्कृति की गुणवत्ता के लिए आवश्यक है. दूसरा, pyrumycin केवल सेल के लिए जोड़ा जाना चाहिएसंस्कृति के पहले 2 दिनों में इस्तेमाल किया संस्कृति के माध्यम से, अब आवेदन वृद्धि हुई MBMEC कोशिका मृत्यु और कम गुणवत्ता बाधा समारोह को जन्म दे सकता है. तीसरा, इस प्रोटोकॉल में लागू एंजाइमों निर्माता के निर्देशों के अनुसार इस्तेमाल किया और संग्रहित किया जाना चाहिए; अन्यथा उनके उचित समारोह समझौता किया जा सकता है. Endothelial कोशिकाओं देते नहीं है अगर इसके अलावा, सेल संस्कृति प्लेटों की कोटिंग संशोधन किया जा सकता है. फ़ाइब्रोनेक्टिन और कोलेजन की सांद्रता बदला जा सकता है या अन्य मैट्रिक्स प्रोटीन कोटिंग समाधान के लिए जोड़ा जा सकता है. अन्त में, उम्र, लिंग, जानवरों की सुविधा के भीतर वर्ष और पर्यावरण की स्थिति का मौसम MBMEC अलगाव और प्रयोगों की तुलनीयता की गुणवत्ता प्रभावित हो सकता है कि महत्वपूर्ण कारक हैं. यह स्थितियों के स्वतंत्र प्रयोगों के बीच तुलना कर रहे हैं कि यह सुनिश्चित किया जाना चाहिए.

वर्णित प्रोटोकॉल murine BMECs अलग करने के लिए एक बुनियादी neuroimmunological विधि के रूप में माना जाना चाहिए. अलग कक्षों यू हो सकता हैऐसे प्रवास assays के, जीन और प्रोटीन अभिव्यक्ति पढ़ाई, electrophysiological मूल्यांकन या पारगम्यता प्रयोगों के रूप में बीबीबी समारोह में और अधिक जानकारी हासिल करने के लिए आवेदनों की एक विस्तृत विविधता के लिए SED. जैसा कि ऊपर कहा, BMECs की 3 डी सेल संस्कृति सिस्टम NVU के संदर्भ में BBB के विनियमन में शामिल जटिल तंत्र का अध्ययन करने के लिए नए अवसर उपलब्ध हो सकता है. इसलिए, प्राथमिक endothelial कोशिकाओं का अलगाव भविष्य में बीबीबी अनुसंधान के क्षेत्र में एक अमूल्य तकनीक रहेगा.

Materials

bFGF	Peprotech	100-18B	Basic fibroblast growth factor
BSA	Sigma Aldrich	A9418	Bovine serum albumine
Collagenase CLS2	Worthington	LS004176	High relative level of protease activity
Collagenase-dispase	Roche	10269638001	Collagenase from V. alginolyticus, Dispase from B. polymyxa
Collagen IV	Sigma Aldrich	C0543	From Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane
DMEM	Sigma Aldrich	D5030	Warm in 37 °C water bath before use
DNAse	Sigma Aldrich	D4513	Deoxyribonuclease I from bovine pancreas
FCS	Sigma Aldrich	F6178	Fetal calf serum (also named fetal bovine serum)
Heparin	Sigma Aldrich	H3393	Anticoagulant
PDS	First Link UK Ltd.	60-00-850	Plasma-derived serum
Percoll	Sigma Aldrich	P1644	Warm to room temperature before use
Pyrumycin	Sigma Aldrich	P8833	Should only be used in first 2 d of culture