Whole-mount Imaging van Muis Embryo Sensory Axon Projecties
Summary
We present here an optimized protocol to genotype, stain and prepare fetal mice for the imaging of peripheral nociceptor axon projections in the whole animal, as an effective method to assess sensory axon growth phenotypes in developing genetically engineered mice.
Abstract
De visualisatie van volledige lengte neuronale uitsteeksels in embryo is essentieel voor een begrip van hoe zoogdieren neuronale netwerken ontwikkelen krijgen. Hier beschrijven we een methode om te labelen in situ een subset van de dorsale wortel ganglion (DRG) axon projecties om hun fenotypische kenmerken te beoordelen met behulp van verschillende genetisch gemanipuleerde muis lijnen. De TrkA-positieve neuronen zijn nociceptorneuronen, gewijd aan de overdracht van pijnsignalen. We maken gebruik van een TrkA- taulacZ muis lijn naar de trajecten van alle TrkA-positieve perifere axonen de etikettering in de intacte muis embryo. We de TrkA taulacZ lijn op een Bax null achtergrond, die hoofdzakelijk opheft neuronale apoptose verder kweken, om groei vragen onafhankelijk van mogelijke effecten van genetische manipulaties op neuronale overleving te bepalen. Vervolgens genetisch gemodificeerde muizen die van belang zijn gefokt met de TrkA TaulACZ / Bax nul lijn en zijn dan klaar voor studie met behulp van de hierin beschreven technieken. Deze presentatie bevat gedetailleerde informatie over muis kweekplannen, genotypering ten tijde van dissectie, weefselbereiding, kleuring en opheldering mogelijk te maken visualisatie van volledige lengte axonale trajecten geheel-mount preparaat.
Introduction
Vaststelling van nauwkeurige neuronale netwerken is een complex ontwikkelingsproces essentieel voor de werking van het zenuwstelsel. Verstoring van dit proces leidt tot neuronale disfunctie die is betrokken bij humane neurologische aandoeningen 1-3. Om de onderliggende moleculaire mechanismen van axon groei en target innervatie bij zoogdieren bestuderen, hebben we een protocol om de axonale trajecten van TrkA tot expressie sensorische neuronen met een combinatie van twee genetisch gemodificeerde muizenlijnen visualiseren ontwikkeld.
TrkA is een receptor voor zenuwgroeifactor NGF en een functionele merker van nociceptieve sensorische neuronen 4. TrkA is sterk uitgedrukt in nociceptieve neuronen tijdens de vroege ontwikkeling en bemiddelt NGF-afhankelijke neuron overleving, axon groei, arborization en target innervatie 5-9. In TrkA taulacZ muizen, wordt het wild-type TrkA-gen vervangen door een taulacZ uitdrukking cassette 10, zodanig dat de axonale morfologie vermeende TrkA-positieve neuronen kunnen worden gevisualiseerd door β-gal (X-gal) kleuring 11. Met een heterozygote TrkA taulacZ / WT lijn, kunnen we factoren die kunnen reguleren of interfereren met de ontwikkeling van sensorische afferente projecties in vivo onderzocht.
Bovendien TrkA expressie afwezig is in homozygote TrkA taulacZ / taulacZ muizen, die dus kunnen worden gebruikt om de axon groei bevorderende mechanismen in de afwezigheid van NGF / TrkA signalering beoordelen. Aangezien nociceptieve neuronen afhankelijk NGF / TrkA signalering niet alleen axon groei, maar ook om te overleven, gebruiken we een muis lijn, zonder de pro-apoptotische Bax gen apoptose remmen embryonale DRG neuronen te redden van celdood die anders is waargenomen in de afwezigheid van TrkA signalering. De Bax – / – achtergrond 12 zorgt daarmee voor de molecuLAR dissectie van signaalwegen die specifiek van invloed zijn axongroei 7-9,13-15. In TrkA- – / -: Bax – / – muizen, DRG neuronen overleven, maar sensorische afferente innervatie in de huid wordt volledig afgeschaft 14,15. We kunnen selectief activeren signaalwegen hun respectieve bijdragen aan de ontwikkeling van axon projecties te bepalen. De bruikbaarheid van deze methode is dat het de beoordeling van veranderingen in axonale groei fenotypes wanneer verschillende genetische modificaties worden gekweekt op de TrkA taulacZ / taulacZ: Bax – / – of TrkA taulacZ / WT: Bax – / – achtergronden.
Protocol
Representative Results
Discussion
De hierboven beschreven X-gal kleuring van embryonale TrkA taulacZ muizen zorgt voor een snelle en nauwkeurige visualisaties van interlokale axon projecties in het intacte embryo vastgesteld. Door de Bax nul achtergrond deze muizen oog op het aftasten van signalering mechanismen die kunnen bijdragen aan zowel axon groei en neuronale overleving. Paring met transgene of knockout muizen interessant maakt voor een uitgebreide evaluatie van de axonale fenotypes en kan als nuttige leidraad voor to…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen graag Dr Louis Reichardt bedanken voor de TrkA taulacZ muizen en Dr. Annette Markus voor inzichtelijke discussie en suggesties. Dit werk werd ondersteund door het opstarten van fondsen van de Burke Stichting en Whitehall Foundation onderzoeksbeurs 2010-08-61, een onderzoeksbeurs van Wings for Life Foundation (WFL-US-028/14), verlenen ZB1-1102-1 uit de Christopher & Dana Reeve Foundation, en subsidies 1R01EY022409 en 3R01EY022409-01S1 van het National Eye Institute, om JZ. KJO is een Goldsmith collega.
Materials
| Company | Catalog Number | |
| PFA | Sigma-Aldrich | P6418 |
| PBS | Life Tech | 10010-023 |
| Tissue Rinse Solution A | Millipore | BG-6-B |
| Tissue Rinse Solution B | Millipore | BG-7-B |
| Tissue Stain Base Solution | Millipore | BG-8-C |
| X-gal | Sigma-Aldrich | B4252 |
| Glass scintiallation vial | Kimble Chase | 74500-20 |
| Incubator | Labline | Model 120 |
| Insect pins | FST | 26000-30 |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 |
| 6 well dish | USA Scientific | CC7672-7506 |
| Primers | IDT | custom DNA primers |
| Takara dNTP mixture | Takara | 4030 |
| Takara LA buffer | Takara | RR002A |
| Takara LA Taq | Takara | RR002A |
| PCR machine | Bio-Rad | DNA Engine Dyad |
| Benzyl alcohol | Sigma-Aldrich | B-1042 |
| Benzyl benzoate | Sigma-Aldrich | B-6630 |
| Dissecting microscope | Leica | M205A |
| Camera | Leica | DFC310FX |
| Ring light | Leica | MEB110 |
| Photoshop | Adobe | Photoshop 4.0 |
References
- Verze, L., et al. Cutaneous innervation in hereditary sensory and autonomic neuropathy type IV. Neurology. 55, 126-128 (2000).
- Sethna, N. F., Meier, P. M., Zurakowski, D., Berde, C. B. Cutaneous sensory abnormalities in children and adolescents with complex regional pain syndromes. Pain. 131, 153-161 (2007).
- Uceyler, N., et al. Small fibers in Fabry disease: baseline and follow-up data under enzyme replacement therapy. J Peripher Nerv Syst. 16, 304-314 (2011).
- Reichardt, L. F., Mobley, W. C. Going the distance, or not, with neurotrophin signals. Cell. 118, 141-143 (2004).
- White, F. A., et al. Synchronous onset of NGF and TrkA survival dependence in developing dorsal root ganglia. J Neurosci. 16, 4662-4672 (1996).
- Farinas, I., Wilkinson, G. A., Backus, C., Reichardt, L. F., Patapoutian, A. Characterization of neurotrophin and Trk receptor functions in developing sensory ganglia: direct NT-3 activation of TrkB neurons in vivo. Neuron. 21, 325-334 (1998).
- Markus, A., Zhong, J., Snider, W. D. Raf and akt mediate distinct aspects of sensory axon growth. Neuron. 35, 65-76 (2002).
- Kuruvilla, R., et al. A neurotrophin signaling cascade coordinates sympathetic neuron development through differential control of TrkA trafficking and retrograde signaling. Cell. 118, 243-255 (2004).
- Zhong, J., et al. Raf kinase signaling functions in sensory neuron differentiation and axon growth in vivo. Nature. 10, 598-607 (2007).
- Bulfone, A., et al. An olfactory sensory map develops in the absence of normal projection neurons or GABAergic interneurons. Neuron. 21, 1273-1282 (1998).
- Moqrich, A., et al. Expressing TrkC from the TrkA locus causes a subset of dorsal root ganglia neurons to switch fate. Nature. 7, 812-818 (2004).
- Knudson, C. M., Tung, K. S., Tourtellotte, W. G., Brown, G. A., Korsmeyer, S. J. Bax-deficient mice with lymphoid hyperplasia and male germ cell death. Science. 270 (5233), 96-99 (1995).
- Lentz, S. I., Knudson, C. M., Korsmeyer, S. J., Snider, W. D. Neurotrophins support the development of diverse sensory axon morphologies. J. Neurosci. 19, 1038-1048 (1999).
- Patel, T. D., Jackman, A., Rice, F. L., Kucera, J., Snider, W. D. Development of sensory neurons in the absence of NGF/TrkA signaling in vivo. Neuron. 25, 345-357 (2000).
- Donovan, K. J., et al. B-RAF kinase drives developmental axon growth and promotes axon regeneration in the injured mature CNS. The Journal of experimental medicine. 211, 801-814 (2014).
- Mercer, K., et al. Expression of endogenous oncogenic V600EB-raf induces proliferation and developmental defects in mice and transformation of primary fibroblasts. Cancer research. 65, 11493-11500 (2005).
- Tronche, F., et al. Disruption of the glucocorticoid receptor gene in the nervous system results in reduced anxiety. Nature genetics. 23, 99-103 (1999).
- Madisen, L., et al. A toolbox of Cre-dependent optogenetic transgenic mice for light-induced activation and silencing. Nat Neurosci. 15, 793-802 (2012).
- Feng, G., et al. Imaging Neuronal Subsets in Transgenic Mice Expressing Multiple Spectral Variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
- Schmidt, H., Rathjen, F. G. DiI-labeling of DRG neurons to study axonal branching in a whole mount preparation of mouse embryonic spinal cord. J Vis Exp. , (2011).
