La jonction neuromusculaire (JNM) est altérée dans diverses affections qui peuvent parfois aboutir à une insuffisance synaptique. Ce rapport décrit des méthodes basées sur le microscope à fluorescence pour quantifier de tels changements structurels.
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Article de méthode
La jonction neuromusculaire: Synapse mesurer la taille, fragmentation et les changements dans Synaptic Protein densité en utilisant microscopie de fluorescence confocale
Dans cet article
Résumé
Résumé
La jonction neuromusculaire (JNM) est le grand, le relais synapse cholinergique par lequel les neurones moteurs de mammifères contrôlent contraction des muscles volontaires. Les changements structurels au NMJ peuvent entraîner l'échec de la neurotransmission, résultant dans la faiblesse, l'atrophie et même la mort de la fibre musculaire. De nombreuses études ont étudié comment les modifications génétiques ou de maladies peuvent modifier la structure de la jonction neuromusculaire de la souris. Malheureusement, il peut être difficile de comparer directement les résultats de ces études parce qu'ils travaillent souvent différents paramètres et les méthodes analytiques. Trois protocoles sont décrits ici. La première utilise la projection d'intensité maximale images confocales pour mesurer la surface des récepteurs de l'acétylcholine (RACh) riche domaines membranaires post-synaptiques à la plaque d'extrémité et la surface de la vésicule synaptique coloration dans la terminaison nerveuse présynaptique sus-jacente. Le deuxième protocole compare les intensités relatives des immunocoloration des protéines synaptiques dans la membrane post-synaptique. La troisième protocole utilise Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) pour détecter les changements dans l'emballage d'AChR post-synaptiques à la plaque d'extrémité. Les protocoles ont été développé et affiné au cours d'une série d'études. Les facteurs qui influencent la qualité et la cohérence des résultats sont discutés et données normatives sont fournis pour NMJs chez les jeunes souris adultes en bonne santé.
Introduction
La jonction neuromusculaire (JNM) est la synapse de relais essentiel qui médie la communication entre le système nerveux et le muscle squelettique. Il est nécessaire pour tout mouvement volontaire. La microscopie à fluorescence a longtemps été utilisé pour étudier les effets des transgènes sur la souris NMJ 1-3 ou de comparer les effets de l'âge, l'alimentation, l'exercice et la maladie sur NMJs de rongeurs 4-11. Ces études nous ont beaucoup appris sur la physiologie et la physiopathologie de la NMJ, mais les divers paramètres déclarés (par exemple, la zone AChR, zone flasque, longueur du périmètre, indices de fragmentation)....
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Protocole
REMARQUE: Conception, réalisation et l'enregistrement de l'expérimentation animale devraient tenir compte des lignes directrices actuelles 24. Ce travail doit être approuvée à l'avance par l'autorité de protection des animaux locale (dans notre cas, le Comité d'éthique animale de l'Université de Sydney).
1. L'euthanasie de l'animal et Muscle Dissection
- Transférer la souris à partir de la salle d'attente dans une salle séparée où il est euthanasié par une injection intrapéritonéale de solution de pentobarbital (30 mg / kg) en utilisant la méthode de manipulation de la souris détaillé par Shimizu 25. Placez la souris de nouveau ....
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Résultats
Mesure de Synaptic zone au NMJ
Toute estimation de la zone repose sur le dessin d'une frontière à définir l'étendue de spécialisations synaptiques. Chez les jeunes adultes en bonne santé muscles images NMJ devraient afficher limites bien définies à la fois pour AChR et synaptophysine coloration (figure 2A et B). L'intensité de fluorescence à la fois pour la synaptophysine AChR et augmente brusquement à la limite entre la partie péri-synaptiq.......
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Discussion
Les protocoles décrits ici nous ont permis de mesurer de manière fiable et quantifier les changements dans les propriétés de la NMJ toute une gamme de conditions, notamment le vieillissement et les maladies états normaux. Les méthodes décrites pour en Face images NMJ permettront aux chercheurs de comparer le domaine des spécialisations pré- et post-synaptiques et la région synaptique de chevauchement / alignement. Pour comparer l'intensité relative des protéines pré- et post-synaptiques le deuxième protocole, qui ut.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.
Remerciements
Ce travail a été soutenu par le Conseil national de la santé et de la recherche médicale [570930]. L’imagerie a été réalisée dans l’installation de microscopie avancée de l’Institut Bosch. Les anciens membres du laboratoire, dont les travaux sont cités, sont remerciés pour leur contribution au développement de ces méthodes.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Microscope confocal à balayage | Leica | DM 2000 avec ; Système TCS SP2 | La plupart des microscopes confocaux à balayage doivent convenir. ; |
| Zeiss | LSM 510 Meta ; | ||
| Leica | SPE-II | ||
| Alexa555-a-bungarotoxine (red-BGT) | Life technologies | B35451 | Utilisé pour l’étiquetage AChRs |
| Alexa647-&alpha ;-bungarotoxin (far-red-BGT) | Life technologies | B35450 | Fluorescence rouge lointaine : à peine visible à travers l’oculaire |
| anti-synaptophysin chez le lapin | Life technologies | 18-0130 | lots d’anticorps primaires diffèrent par leur dilution de travail efficace |
| FITC-anti-rapsyn mab1234 | Milipore | FCMAB134F | Anticorps monoclonal conjugué à FITC |
| FITC-donkey anti-rabbit IgG | Jackson | 711-095-152 | qualité des anticorps secondaires polyclonaux peut varier selon la source et le lot |
| Température de coupe optimale (O.T.C.) | ProSciTech | IA018 | Matrice d’enrobage de cryostat pour la congélation des muscles |
| DABCO | Sigma | 10981 | Milieu de montage qui ralentit le photoblanchiment des fluorophores |
Références
- Schmidt, N., et al. Neuregulin/ErbB regulate neuromuscular junction development by phosphorylation of α-dystrobrevin. J Cell Biol. 195, 1171-1184 (2011).
- Amenta, A. R., et al. Biglycan is an extracellular MuSK binding ....
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Réimpressions et autorisations
