파장과 산화 스트레스에 레드 / 근적외선 치료의 강렬의 범위의 효과의 평가를위한 방법<em> 체외</em
Summary
Non-coherent Xenon light was passed through narrow-band interference and neutral density filters to deliver light of varying wavelength and intensity to cultured cells. This protocol was used to assess the effects of red/near-infrared light therapy on production of reactive species in vitro: no effects were observed using the tested parameters.
Abstract
레이저 또는 발광 다이오드 (LED)에 의해 전달 레드 / 근적외선 요법 (R / NIR-LT)은, 아마도 산화 스트레스를 감소시킴으로써 생체 내에서 중추 신경계 손상, 범위의 기능적 형태 학적 결과를 개선시킨다. 그러나, 산화 스트레스에 R / NIR-LT의 효과는 파장 또는 조사의 강도에 따라 달라질 것으로 나타났다. 치료 매개 변수를 비교하는 연구로 인해 체외 최적화 연구에 넣어 통해 높은에 적합한 여러 파장이나 강도를 제공 상업적으로 사용 가능한 장치의 부재로, 부족하다. 이 프로토콜은 주어진 손상 모델에 필요한 치료 용량을 최적화하는 파장과 강도의 범위에서 빛의 전달을위한 기술을 설명한다. 우리는 파장 및 강도 파라미터를 쉽게 변경 될 수있는 빛을 전달하는 방법은, 활성 산소 종을 감소시키기위한 R / NIR-LT의 최적 투여 량의 결정을 용이하게 할 수 있다는 가설을 세웠다시험 관내 (ROS).
비 간섭 제논 라이트는 다양한 파장 (440, 550, 670의 중심 파장 및 810) 및 플루 언스 제공하는 협 대역 간섭 필터를 통해 여과 (8.5 × 10 -3 3.8을 × 10 -1 J / cm 2) 빛의 배양 된 세포에. 장치에서 빛 출력은 각각의 파장에서 빛의 치료 관련, 동일한 계량 적 투여 량을 방출하도록 조정했다. 글루타메이트는 DCFH-DA 및 H 2 O 2에 민감한 형광 염료를 사용하여, 광 처리 된 세포 스트레스에 반응 종을 검출 하였다.
우리는 성공적으로 CNS 손상의 모델로 글루타민산 염에 노출 배양 된 세포에 관련 파장 및 강도 생리 및 치료의 범위에서 빛을 전달했다. 배양 된 세포에 의해 생성 된 ROS에 영향을주지 않았다 현재 연구에 사용 된 R / NIR-LT의 플루 언스 반면, 빛의 전달 방법은 다른 SYST에 적용 할 수있다EMS 더 중요한 생리 학적 또는 미토콘드리아 Organotypic 슬라이스 배양 모델을 포함한 절연 및 산화 대사의 결과 측정의 범위에 영향을 평가하기 위해 사용될 수있다.
Introduction
반응성 산소 종 (ROS)의 신호 전달 경로와 하나의 신경 세포를 포함한 정상적인 대사 반응의 범위에 대해 요구된다. 내인성 항산화 메커니즘은 ROS의 생성을 제어 할 수없는 때, 세포는 산화 스트레스에 굴복 2,3-있다. CNS에 손상 후, ROS 및 산화 스트레스의 존재가 증가 연관된 손상 4,5의 진행에 중요한 역할을하는 것으로 생각된다. 평가 된 산화 스트레스를 감쇠하기위한 전략의 광대 한 수에도 불구하고, 신경 외상 (6) 다음의 임상 사용 ROS 생산과 관련된 산화 스트레스를 감쇠에 대한 완전히 효과, 임상 적으로 관련된 항산화 전략은 현재 존재하지 않는다. 따라서 산화 스트레스의 감쇠는 치료 적 개입 7에 대한 중요한 목표 남아있다.
개선 사항은 다음과보내고 R / NIR-LT는 부상 아마도 산화 스트레스를 줄임으로써 심근 경색 크기, 당뇨병 및 간 동안 신장 합병증, 망막 변성, CNS 손상 및 뇌졸중 (8)의 감소를 포함하여 다양한 질환에서보고되었다. CNS 부상에 특히 관련하여, 670nm의 빛의 효능 임상 연구는 망막 변성 9-11, 척수 손상 (12), 신경 세포의 죽음 (13)의 모델에 좋은 효과를 보여 주었다. 임상 시험은 그러나이 실험의 결과는 15 매개 변수 효과적인 치료를 사용하는 것이 아마도 장애로 인해 유망 나타나지 않습니다, 황반 변성 관련 마른 나이 수행과 뇌졸중 (14)에 대해 현재 진행되고있다. 따라서, R / NIR-LT 널리 비 침습적, 관리하기 쉽고 상대적으로 저렴한 치료에도 불구하고, 신경 외상 정상 임상 실습의 일환으로 채택되지 않았습니다. 임상 번역 장벽은 CL의 부족을 포함초기 표준화 효과적인 치료 프로토콜 16, 17의 행동과 부재의 메커니즘을 이해했다. 빛 치료에 대한 현재 문헌 조사 소스에 대해 (LED 또는 레이저), 파장 (예를 들어, 630, 670, 780, 810, 830, 880, 904nm), 조사의 총 용량 (주울 / 치료 매개 변수의 변화의 과다를 보여 단위 영역), 지속 시간 (노광 시간), 타이밍 (예정 모독 또는 포스트), 치료의 빈도 및 전달 모드 () 펄스 또는 연속 8. 연구와 치료 매개 변수의 변동성 비교 어렵고 효능 (16)에 대한 회의론에 기여하고있다.
따라서, R / NIR-LT의 최적화는 명확 여러 변수를 비교하는 데 필요한 높은 처리량 스크리닝 기법을 제공 할 수있는 세포 배양 시스템이 필요하다. 그러나 워싱턴를 통해 충분한 유연성과 제어를 제공 할 수 몇 상업적으로 이용 가능한 조명 시스템이 있습니다velength 강도는 최적화 실험을 수행 할 수 있습니다. 시판 LED 장치는 일반적으로 강도뿐만 아니라 다를 수 있습니다 다른 제조 업체, 여러 LED 소자를 사용하는 연구자의 결과로 여러 파장이나 강도를 제공 할 수뿐만 아니라 방출되는 빛의 파장의 스펙트럼하지 않습니다. 우리는 따라서 R / NIR-LT의 파라미터의 근접, 정확한 제어를 허용하며, 파장 및 빛의 플루 언스의 범위를 생성하는 협 대역 간섭 필터를 통해 여과 광대역 크세논 광원을 사용함으로써이 문제를 해결했다.
그것은 치료의 치료 학적 투여 량은 R / NIR-LT의 경우 사이토 크롬 C 산화 효소 (COX) (18)로 가정하고, photoacceptor (발색단)와 상호 작용하는 광자의 수에 의해 정의된다는 점에주의하는 것이 중요하다. 전달 광자 에너지는 파장에 따라 달라집니다; 서로 다른 파장의 에너지의 동일한 용량을 의미하는 것은 COM 될 것입니다광자의 상이한 수의 입상. 따라서, 소자로부터 방출 된 광이 테스트에 선택된 파장의 광자를 각각 동일한 수의 방출하도록 조정 하였다. 생체 외에서 세포의 파장과 강도의 범위에서 R / NIR-LT를 전달하는데 사용될 수있는 시스템을 개발하고 실시 세포에서 ROS 생성에 전달되는 R / NIR-LT의 효과를 측정 할 수있는 능력을 입증 글루타민산 염 스트레스.
Protocol
Representative Results
Discussion
우리는 성공적이 R / NIR-LT 시험관 최적화 연구기구를 제공하기 위해 정밀한 보정 광 전송 시스템을 채택했다. R의 파장 및 강도 파라미터 / NIR-LT는이 시스템을 이용하여 정확하고 효율적으로 조작 될 수있다. ROS 테스트 세포 유형에서 제공되는 파장과 투여 량 감소되지 않았다하더라도 우리는 세포 죽음으로 이어질하지 않은 세포의 빛 치료를 설립했다. 670nm (20.11W / m 2)에서 현재 시?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Neurotrauma Research Program (Western Australia). This project is funded through the Road Trauma Trust Account, but does not reflect views or recommendations of the Road Safety Council.
Materials
| OxiSelect Intracellular ROS Assay Kit (Green Fluorescence) | Cell Biolabs | STA-342 | |
| Amplex UltraRed Reagent | Molecular Probes | A36006 | |
| 300 Watt Xenon Arc Lamp | Newport Corporation | 6258 | Very intense light source, do not look directly into the lamp. Ensure there is sufficient cooling to the lamp whilst it is switched on |
| USB4000-FL Fluorescence Spectrometer | Ocean Optics | – | |
| CC-3-UV Cosine Corrector for Emission Collection | Ocean Optics | – | |
| 200μm diameter quartz fibre optic | Ocean Optics | – | |
| SpectraSuite Spectroscopy Platform | Ocean Optics | – | |
| 2300 EnSpire Multimode Plate Reader | Perkin Elmer | – | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | Acute toxicity, wear gloves when handling. |
| L-Glutamic acid monosodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | 142-47-2 (anhydrous) | |
| Pheochromocytoma rat adrenal medulla (PC12) cells | American Type Culture Collection | CRL-2522 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI1640) Media | Gibco | 11875-119 | |
| Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin | Gibco | 10082-147 | Warm to 37°C in water bath before use |
| Horse Serum, New Zealand origin | Gibco | 16050-122 | Warm to 37°C in water bath before use |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050-061 | Warm to 37°C in water bath before use |
| 100 mM Sodium Pyruvate | Gibco | 11360-070 | Warm to 37°C in water bath before use |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | Warm to 37°C in water bath before use |
| 100X MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Gibco | 11140-050 | Warm to 37°C in water bath before use |
| Retinal Muller (rMC1) cells | University of California, San Diego | – | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11965-118 | Warm to 37°C in water bath before use |
| 75cm2 Flasks | BD Biosciences | B4-BE-353136 | |
| Poly-L-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | 25988-63-0 | Aliquot and store at -20°C |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14025-134 | Warm to 37°C in water bath before use |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Gibco | 10010-049 | Warm to 37°C in water bath before use |
| Laminin Mouse Protein, Natural | Gibco | 23017-015 | Aliquot and store at -20°C |
| 1X Neurobasal Medium | Gibco | 21103-049 | Warm to 37°C in water bath before use |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250-061 | |
| 165U Papain | Worthington | – | |
| L-Cysteine | Sigma-Aldrich | W326305 | |
| Corning 96 well plates, clear bottom, black | Corning | CLS3603-48EA | |
| Costar Clear Polystyrene 96-Well Plates Untreated; Well shape: Round; Sterile. | Costar | 07-200-103 | |
| Seesaw Rocker | Standard lab epuipment | – | |
| Centrifuge | Standard lab epuipment | – | |
| Neutral Density Filter Paper (0.3) | THORLABS | – | |
| 442nm Bandpass Filter | THORLABS | FL441.6-10 | |
| 550nm Bandpass Filter | THORLABS | FB550-10 | |
| 670nm Bandpass Filter | THORLABS | FB670-10 | |
| 810nm Bandpass Filter | THORLABS | FB810-10e | |
| Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.1) | THORLABS | NE01B | |
| Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.2) | THORLABS | NE02B | |
| Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.3) | THORLABS | NE03B | |
| Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.5) | THORLABS | NE05B | |
| Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.6) | THORLABS | NE06B | |
| Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (1.0) | THORLABS | NE10B |
References
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