פיתוח<em> במבחנה</em> מערכת מודל לחקר האינטראקציה של<em> Equus</em><em> Caballus</em> IgE עם קולטן גבוה הזיקה שלה FcεRI
Summary
The current study describes the development and applications of a genetically engineered assay system based on the transfection of rat basophilic leukemia cells with the equine FcεRIα gene. Transfected cells express a functional receptor where the release of mediators of the allergic response can be activated by IgE and antigen.
Abstract
The interaction of IgE with its high-affinity Fc receptor (FcεRI) followed by an antigenic challenge is the principal pathway in IgE mediated allergic reactions. As a consequence of the high affinity binding between IgE and FcεRI, along with the continuous production of IgE by B cells, allergies usually persist throughout life, with currently no permanent cure available. Horses, especially race horses, which are commonly inbred, are a species of mammals that are very prone to the development of hypersensitivity responses, which can seriously affect their performance. Physiological responses to allergic sensitization in horses mirror that observed in humans and dogs. In this paper we describe the development of an in situ assay system for the quantitative assessment of the release of mediators of the allergic response pertaining to the equine system. To this end, the gene encoding equine FcεRIα was transfected into and expressed onto the surface of parental Rat Basophil Leukemia (RBL-2H3.1) cells. The gene product of the transfected equine α-chain formed a functional receptor complex with the endogenous rat β- and γ-chains 1. The resultant assay system facilitated an assessment of the quantity of mediator secreted from equine FcεRIα transfected RBL-2H3.1 cells following sensitization with equine IgE and antigenic challenge using β-hexosaminidase release as a readout 2, 3. Mediator release peaked at 36.68% ± 4.88% at 100 ng ml-1 of antigen. This assay was modified from previous assays used to study human and canine allergic responses 4, 5. We have also shown that this type of assay system has multiple applications for the development of diagnostic tools and the safety assessment of potential therapeutic intervention strategies in allergic disease 6, 2, 3.
Introduction
אלרגיה ידועה כבר אלף שנים. טיפול באסתמה תואר בטקסט הרפואי המצרי העתיק המכונה פפירוס אברס (~ לפנה"ס 1550) ודן בתרופות צמחיות לטיפול בזה 7.
אלרגיה היום מסווגת כתגובה רגישות יתר מהסוג I, שבו סוג T התא עוזר 2 (TH 2) הזרוע של מערכת החיסון מנווטת את הייצור של נוגדני אימונוגלובולין E (IgE) בתגובה לאנטיגנים סביבתיים הנקראים אלרגנים. אלה הם חומרים מגוונים שאינטראקציה בדרך כלל עם תאים במערכת החיסונית ולהמריץ את הסינתזה והפרשה של ציטוקינים פרו-דלקתיים, כולל interleukin-4 וinterleukin-13 8, 9 כאל חלקיקים בחלקיקי עשן סיגריות או דיזל אשר משפרות סינתזת IgE 10.
העלייה בגילויים אלרגיים במדינות מתועשות ב -50 השנים האחרונות, שיוחסה לשילוב של ההשפעהמזהמים סביבתיים ומגמה לסביבה יותר מחוטא, המשלבים להעביר את התגובה החיסונית כלפי פרופיל שלט על ידי TH 2 ציטוקינים, כפי שהוצע על ידי "היגיינה השערה '11.
כפי שצוין לעיל, בני האדם אינם יונקים רק נגוע באלרגיה. יש לציין סוסים וכלבים גם יכולים לפתח תגובות אלרגיות קלאסיות ומחקר על ידי 12 הראה כי, כמו אצל בני אדם, אלרגיה לסוסים מיוחסת לגורמים גנטיים וסביבתיים. כתוצאה מכך, בעלי החיים הללו מהווים מודל טוב ללימוד יחסי הגומלין בין גורמים הגנטיים וסביבתיים של אלרגיה, ההתקדמות שלה מרגישות למחלה, ואסטרטגיות התערבות אפשריות פעם אחת ביטויים קליניים שהגדרתם ב
בשנת 1887, Stömmer היה האדם הראשון שתאר את הדמיון בין האדם ואסטמה סוסי 13, ההשפעה של היסטמין על מערכת לב וכלי דם הסוסים היאדומה מאוד לזו של בני אדם 14. סוסים הם גם אבן הפינה של התעשייה מרוצי הסוסים, שהוא בשווי $ 72000000000 עם מחזור הימורים של 115 מליארד דולרים בשנה 15.
רוב סוסי מרוץ העכשוויים הם צאצאים של המספר הקטן של סוסים ערביים הגזעיים על ידי ליידי אן בלאנט מהשינה 1878 ואילך. סוסי מרוץ מודרניים בדרך כלל ממולדים כדי לבחור ליכולות ביצועים. הם נוטים להפרעות גנטיות, שאחד מהם היא הרגישות שלהם להר תגובות אלרגיות. יש להם גם 1000 פעמים רמות גבוהות יותר IgE בסרום יותר אפילו בני האדם 16 ביותר אלרגי קשה. תגובות אלרגיות סוסים בדרך כלל באות לידי ביטוי כרגישות יתר עקיצת חרק (IBH) 17, 18. תוצאות IBH בדלקת עור כתוצאה מעקיצות חרקים מהוות בסוג Culicoides. צורה נוספת של מחלה אלרגית סוסים היא חסימות בדרכי נשימה חוזרות ונשנות (Rao), זה באו לידי ביטוי בבריאות ובדרכי הנשימה. הוא מאופיין על ידי צפצופים ומעבדהנשימה כבדה. לשכה לביקורת מתרחשת בדרך כלל בתגובה לעצב נבגים, ורמות IgE לאלרגן ספציפי גבוהות נרשמו בסוסים שסבלו מלשכה לביקורת במחקר אחד 19 למרות שחקירה עוד לא אישרה 20 זה.
מחקרים על אלרגיה לסוסים סובבים סביב הניסיון בניטור ונטרול IgE סוסים על ידי פיתוח נוגדנים נגד סוסים IgE חד שבטיים (מבז) 21, 22. יתר על כן המחקר של 23 דן בייצור של תחומים תאיים של α של גבוהה-זיקת קולט Fc הסוסים קולט שרשרת (FcεRIα) בניסיון לזהות ולכמת בסרום סוסי IgE. במחקר נלווה על ידי 24 Ledin דן בגישה חדשה שמטרתה לנטרל IgE בסרום על ידי תחול במערכת החיסון בimmunogen עצמי שאינם עצמי /. כל המחקרים הללו, עם זאת, היו חסרים assay יעיל על מנת לבחון את הבטיחות ויעילות של הפרוטוקולים שלהם. במאמר זה, אנחנו עכשיו נציג נתונים כאלה sys assayTEM החלים על המחקר של אסטרטגיות אבחון וטיפול רלוונטיות למערכת הסוסים, שבו שחרור β-hexosaminidase, כמדד לdegranulation מתווך תא, הוערך על תאי RBL-2H3.1 להביע FcεRIα סוסים. פרוטוקול זה מבוסס על פרסומים קודמים 25, 4, 5, 2, 3 המתארים את ההנדסה של תאי RBL transfected עם הגן המקודד את תחום מחייב IgE של קולט גבוה הזיקה לIgE ממינים שונים. הפרוטוקול מסביר כיצד לבצע assay שחרור β-hexosaminidase, שתוצאותיה מוצגות כממוצע ± סטיית תקן של ניסויים בשלושה עותקים.
Assay השחרור היה ראשון שפותח על ידי Siraganian והוק 25 ללמוד אלרגיה אנושית. קבוצת המעבדה בראשותו של ד"ר ראובן Siraganian גם פיתחה את קו תא RBL. תאי RBL אלו פותחו להביע FcεRIα האדם והפרוטוקול פורסם על ידי 4. החלק האחרוןשל assay הגיע עם הפיתוח של פלסמיד PSV בנייר על ידי נויברגר 26 אשר תאר את הייצור של נוגדני IgE על ידי שיבוט גן השרשרת הכבד שלו במורד הזרם של גן עכברי לאזור משתנה IgE שמכוון את hapten 4-הידרוקסי-3 -nitro-phenacetyl (NP), הנוגדן כימרי וכתוצאה מכך היה פונקציונלי מלא. היכולת לפתח כל IgE מיקוד אותו hapten, גם בעת שיבוט לקולטן שלו על פני השטח של תאי RBL הביאו סטנדרטיזציה של assay שהופך אותו פרוטוקול שימושי כדי למדוד את degranulation של תאי זופילים.
Assay עושה יש יתרונות וחסרונות. היתרונות של assay הוא ההסתגלות שלה לשימוש בכל מערכת יונקים, המעבדה שלנו ובכך השתמשה בו כדי לבדוק את degranulation במערכות אנושיות, כלבים וסוסים, וזה הוא בר השגה רק על ידי סינתזת IgE של האורגניזם ושיבוט לקולטן שלו על פני השטח של תאי RBL.
מצד השני,החסרונות של assay הוא שתאי RBL רגישים מאוד לשינויים תרמיים, מכאניים וPH, מה שהופך אותם לתת וריאציה של רמות degranulation בתוך אותו assay. הוא כך מומלץ בחום שהמבחנים תמיד חוזרים על עצמם בtriplicates ולאחר מכן ממוצע שנלקח מהם. יתר על כן, תאי RBL נוטים להעביר לפנוטיפ שאינו משחרר אם הם נשארים בתרבית רקמה לזמנים ממושכים (> 10 שבועות) 27, מה שהופך את התחזוקה שלהם מסורבלת. הם גם נוטים לזיהומים על ידי חיידקי mycoplasma, שאינם גלויים לעין מיקרוסקופ אור ולא לשנות את המורפולוגיה של התא, אך בצורה קיצונית ישנו את רמות degranulation. כך בדיקות mycoplasma רגילות יש צורך.
Protocol
Representative Results
Discussion
לסיכום תוצאות מחקר זה הראו שכאשר תאי RBL-2H3.1 להביע FcεRIα סוסים הם רגישים עם IgE סוסים ולערער על ידי אנטיגן, הם נותנים שחרור מתווך שיא של 36.68% ± 4.88% מהסכום הכולל של מתווך בתוך תאים, בהשוואה לRBL-2H3.1 תאי הורים לא מביעים FcεRIα סוסים.
כך assay זה מס…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Dr. Lynda Partridge for the provision of advice and laboratory facilities.
Materials
| RBL-2H3.1 Expressing Equine FcεRIα | – | – | Produced in the lab |
| Equine IgE anti NIP-HSA | – | – | Produced in the lab |
| 96 Well Plate | Sigma | CLS3595 | – |
| Multi Channel Pipette | Anachem | – | – |
| Incubator | Galaxy R | – | – |
| 4Hydroxy-5-iodo-3-nitrophenylacetic acid | Cambridge Research Biochemicals | N-1070-1 | NIP-OH was conjugated with Human Serum Albumin to make NIP-HSA in the lab |
| Dinitrophenyl Conjugated to Human Serum Albumin | Sigma | A6661 | Abbreviated DNP-HSA |
| Plate Spectrophotometer | Anthos Labtec HT2 | – | – |
| Pipes | Sigma | P1851 | – |
| Sodium Chloride | Sigma | S7653 | – |
| Potassium Chloride | Sigma | P9333 | – |
| Magnesium Chloride | Sigma | M2670 | – |
| Calcium Chloride | Sigma | C1016 | – |
| Triton x100 | Sigma | X100 | – |
| 4-nitrophenyl N-acetyl-β-D-glucosaminide | Sigma | N9376 | Stock solution called β-hexosaminidase substrate was 50mM prepared in DMSO |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma | D2650 | – |
| Citric Acid | Sigma | 251275 | – |
| Sodium Acetate | Sigma | S7670 | – |
| Tris | Sigma | T5941 | – |
References
- Taudou, G., et al. Expression of the Alpha Chain of Human FcεRI in Transfected Rat Basophilic Leukemia Cells: Functional Activation after Sensitization with Human Mite-Specific IgE. Int Arch Allergy Immunol. 100 (4), 344-350 (1993).
- Sabban, S. . Development of an in Vitro Model System for Studying the Interaction of EquuscaballusIgE with Its High-Affinity FcεRI Receptor. , (2011).
- Sabban, S., Ye, H., Helm, B. A. Development of an in Vitro Model System for Studying the Interaction of EquuscaballusIgE with Its High-Affinity Receptor FcεRI. Vet ImmunolImmunopathol. 153 (1-2), 6-10 (2013).
- Wilson, A. P. M., Pullar, C. E., Camp, A. M., Helm, B. A. Human IgE mediates stimulus secretion coupling in rat basophilic leukemia cells transfected with the a chain of the human high-affinity receptor. Eur J Immunol. 23, 240-244 (1993).
- Hunter, M. J., Vratimos, A. P., Housden, J. E. M., Helm, B. A. Generation of canine-human Fc IgE chimeric antibodies for the determination of the canine IgE domain of interaction with FcεRIα. MolImmunol. 45 (8), 2262-2268 (2008).
- Rashid, A., et al. Review: Diagnostic and therapeutic applications of rat basophilic leukemia cells. MolImmunol. 52 (3-4), 224-228 (2012).
- Cohen, S. G. Asthma in antiquity: the Ebers Papyrus. Allergy Proc. 13 (3), 147-154 (1992).
- Dudler, T., et al. A link between catalytic activity, IgE-independent mast cell activation, and allergenicity of bee venom phospholipase A2. J. Immunol. 155, 2605-2613 (1995).
- Machado, D. C., Horton, D., Harrop, R., Peachell, P. T., Helm, B. A. Potential allergens stimulate the release of mediators of the allergic response from cells of mast cell lineage in the absence of sensitization with antigen-specific IgE. Eur J Immunol. 26 (12), 2972-2980 (1996).
- Smyth, L. J., et al. Assessment of the molecular basis of pro-allergenic effects of cigarette smoke. Environ Sci Technol. 34 (7), 1370-1374 (2000).
- Okada, H., Kuhn, C., Feillet, H., Bach, J. F. The ‘hygiene hypothesis’ for autoimmune and allergic diseases: an update. ClinExpImmunol. 160 (1), 1-9 (2010).
- Eder, C., et al. Influence of environmental and genetic factors on allergen-specific immunoglobulin-E levels in sera from Lipizzan horses. Equine Vet J. 33 (7), 714-720 (2001).
- Cook, W. R., Rossdale, P. D. The syndrome of ‘Broken Wind’ in the horse. Proceedings of the Royal Society of Medicine. 56, 972-977 (1963).
- Eyre, P., Lewis, A. J. Acute systemic anaphylaxis in the horse. Br. J. Pharmacol. 48 (3), 426-437 (1973).
- Wagner, B. IgE in horses: occurrence in health and disease. Vet ImmunolImmunopathol. 132 (1), 21-23 (2009).
- Hellberg, W., et al. Equine insect bite hypersensitivity: immunoblot analysis of IgE and IgG subclass responses to Culicoidesnubeculosus salivary gland extract. Vet. Immunol. Immunopathol. 113 (1-2), 99-112 (2006).
- Schaffartzik, A., et al. Equine insect bite hypersensitivity: what do we know. Vet ImmunolImmunopathol. 147 (3-4), 113-126 (2012).
- Künzle, F., et al. IgE-bearing cells in bronchoalveolar lavage fluid and allergen-specific IgE levels in sera from RAO-affected horses. J Vet Med A PhysiolPatholClin Med. 54 (1), 40-47 (2007).
- Tahon, L., et al. In vitro allergy tests compared to intradermal testing in horses with recurrent airway obstruction. Vet ImmunolImmunopathol. (1-2), 85-93 (2009).
- Wagner, B., Radbruch, A., Rohwer, J., Leibold, W. Monoclonal anti-equine IgE antibodies with specificity for different epitopes on the immunoglobulin heavy chain of native IgE. Vet ImmunolImmunopathol. 92 (1-2), 45-60 (2003).
- Wilson, A. D., Harwood, L., Torsteinsdottir, S., Marti, E. Production of monoclonal antibodies specific for native equine IgE and their application to monitor total serum IgE responses in Icelandic and non-Icelandic horses with insect bite dermal hypersensitivity. Vet ImmunolImmunopathol. 112 (3-4), 156-170 (2006).
- McAleese, S. M., et al. Cloning and expression of the extra-cellular part of the alpha chain of the equine high-affinity IgE receptor and its use in the detection of IgE. Vet ImmunolImmunopathol. 110 (1-2), 187-191 (2006).
- Ledin, A., et al. Generation of therapeutic antibody responses against IgE in dogs, an animal species with exceptionally high plasma IgE levels. Vaccine. 24 (1), 66-74 (2006).
- Siraganian, R. P., Hook, W. A. Histamine release and assay methods for the study of human allergy. Manual of Clinical Immunology. , (1980).
- Neuberger, M. S., et al. A hapten-specific chimaericIgE antibody with human physiological effector function. Nature. 314 (6008), 268-270 (1985).
- Bingham, B. R., Monk, P. N., Helm, B. A. Defective Protein Phosphorylation and Ca2+ Mobilization in a low secreting variant of the rat basophilic leukemia cell line. The Journal of Biological Chemistry. 269 (30), 19300-19306 (1994).
- McAleese, S. M., Halliwell, R. E., Miller, H. R. Cloning and sequencing of the horse and sheep high-affinity IgE receptor alpha chain cDNA. Immunogenetics. 1 (51), 878-881 (2000).
- Hongtu, Y. Study of the structure/function relationship in canine and human IgE as the basis for the development of rational therapeutic intervention strategies in allergic disease. , (2010).
- Sabban, S., et al. Towards a pan-anti-allergy vaccine. JIBTVA. 2 (2), 15-27 (2013).
- Moran, G., Burgos, R., Araya, O., Folch, H. In vitro bioassay to detect reaginic antibodies from the serum of horses affected with recurrent airway obstruction. Vet Res Commun. 34, 91-99 (2010).
