Understanding the endogenous molecular changes in adult stem cells during aging requires isolating the cells of interest. The method described here presents a simple and robust approach to enrich for and isolate Drosophila intestinal stem cells and the enteroblast progenitor cells by FACS at any time point during aging.
Aging tissue is characterized by a continuous decline in functional ability. Adult stem cells are crucial in maintaining tissue homeostasis particularly in tissues that have a high turnover rate such as the intestinal epithelium. However, adult stem cells are also subject to aging processes and the concomitant decline in function. The Drosophila midgut has emerged as an ideal model system to study molecular mechanisms that interfere with the intestinal stem cells’ (ISCs) ability to function in tissue homeostasis. Although adult ISCs can be easily identified and isolated from midguts of young flies, it has been a major challenge to study endogenous molecular changes of ISCs during aging. This is due to the lack of a combination of molecular markers suitable to isolate ISCs from aged intestines. Here we propose a method that allows for successful dissociation of midgut tissue into living cells that can subsequently be separated into distinct populations by FACS. By using dissociated cells from the esg-Gal4, UAS-GFP fly line, in which both ISCs and the enteroblast (EB) progenitor cells express GFP, two populations of cells are distinguished based on different GFP intensities. These differences in GFP expression correlate with differences in cell size and granularity and represent enriched populations of ISCs and EBs. Intriguingly, the two GFP-positive cell populations remain distinctly separated during aging, presenting a novel technique for identifying and isolating cell populations enriched for either ISCs or EBs at any time point during aging. The further analysis, for example transcriptome analysis, of these particular cell populations at various time points during aging is now possible and this will facilitate the examination of endogenous molecular changes that occur in these cells during aging.
En uundgåelig konsekvens af at blive gammel er den faldende evne af væv og organer til at forblive funktionelle. Voksne stamceller er afgørende for at opretholde vævshomeostase og organ funktionalitet, men som organismer alder, stamcellerne også opleve et fald i deres biologiske adfærd. Dette er særligt skadelig for væv, som har en høj omsætningshastighed, såsom tarmepitelet. Kendetegnende for alderen stamceller omfatter genomisk skader, nedsat reparationsmekanismer, nedsat cellecyklusregulering og misregulated signalveje, som alle påvirker normal stamcelle adfærd (revideret i 1-3). Ved at manipulere specifikke signalveje eller vælte specifikke gener, har vi fået indblik i deres roller i reguleringen og opretholde normal stamcelle adfærd. Da de fleste af disse forsøg er kandidatmolekylet fremgangsmåder, vi har meget lidt viden om de endogene molekylære forandringer, der sker i stamceller underaldring. En måde at gribe dette spørgsmål er at sammenligne transkriptomet af unge versus gamle stamceller til at identificere molekyler, hvis ekspressionsprofil ændrer væsentligt under ældning. Desværre har biologiske og tekniske udfordringer hæmmet vores fremskridt med hensyn til denne fremgangsmåde hidtil.
Drosophila melanogaster er meget velegnet model organisme for at studere aldring, da det har en kort levetid (ca. 60-70 dage) og udviser aldrende fænotyper (gennemgået i 4). Desuden kan ældningsprocessen i Drosophila accelereres ved temperaturen. Når holde fluerne ved 29 ° C, kan allerede iagttages en gammel fænotype i tarmvævet efter 15 dage 5. Endvidere Drosophila er modtagelig for en overflod af genetiske manipulationer. Navnlig har Drosophila mellemtarmen opstået som en fremragende model til undersøgelse af indflydelsen af forskellige signalveje og miljømæssige udfordringerbiologi intestinale stamceller (HTT) under aldring (revideret i 6-10). Den Drosophila tarmepitelet har en høj omsætningshastighed og fornyes hver anden uge hos kvinder og cirka en gang om måneden hos mænd 11. Individuelle servicekontrakter med bopæl i Drosophila mellemtarmen har kapacitet til at dele sig og producere en selvstændig fornyet ISC og en post-mitotisk progenitorcelle kaldet enteroblast (EB) 12,13. EB differentierer til enten en absorberende enterocytterne eller en sekretorisk enteroendokrin celle. Til denne dato, er den eneste markør kombination, der utvetydigt mærker en ISC er udtryk for transkriptionsfaktoren escargot (ESG) og Notch ligand Delta (DL) 14. Men dette kun gælder for en ung og sund tarm. Under ældning er mellemtarmen epitel kendetegnet ved en stigning i ISC proliferation 15-17. Derudover afvigende Notch signalering forstyrrer skæbne afgørelse af ISC dattercellerog inducerer misdifferentiation EBS 15. Dette resulterer i en ophobning af celler, der er aktive for Notch signalering og co-express ESG og Dl, hvorved Dl ekspression utilstrækkelig til at identificere bona fide stamceller i en gammel mellemtarmen. Vanskeligheden ved at identificere sande individuelle servicekontrakter har hindret mulighed for at undersøge endogene ændringer i aldrende individuelle servicekontrakter indtil nu.
Vi har behandlet dette spørgsmål ved at drage fordel af ESG -Gal4, UAS-GFP transgene fluelinen, hvor niveauet af GFP-ekspression i individuelle servicekontrakter og EBS er i sagens natur anderledes og forbliver anderledes i hele aldring. En lignende fremgangsmåde er blevet beskrevet til isolering af larver neuroblaster og neuroner 18,19. Midguts af unge og gamle ESG -Gal4, UAS-GFP fluer blev dissekeret og dissocieret i enkeltceller. Cellerne blev derefter sorteret for GFP-positive celler under anvendelse af fluorescensaktiveret cellesortering (FACS). Interessant sorteret GFP-positive calen fordelt i to adskilte toppe baseret på GFP-fluorescens intensitet (GFP høj og GFP lav). Desuden er fordelingen af GFP-positive celler i de to toppe også korreleret med cellestørrelse: de celler, der udviste lav GFP intensitet var små og mindre kornet hvorimod celler med høj GFP intensitet var større og mere detaljeret. Denne observation tydede på, at de mindre individuelle servicekontrakter kunne skelnes fra de større EB'er hjælp af FACS baseret på GFP intensitet og vælge passende forward scatter (FSC) og sidespredning (SSC) indstillinger. Interessant nok forblev de to toppe tydeligt adskilt under aldring. Endvidere er forholdet mellem de to toppe ændret på en måde, der afspejler de førnævnte kendetegnende aldrende midguts: nemlig at antallet af store, misdifferentiated EBS stiger over tid. Fra disse resultater konkluderer vi, at ved at sortere for GFP-positive celler under anvendelse af de passende FACS parameterindstillinger kan vi berige for ISC og EB'er på noget tidspunkt dnder aldring.
Sammenfattende indfører vi en FACS strategi, der gør det muligt for forskerne at berige for to forskellige cellepopulationer, individuelle servicekontrakter og EBS fra Drosophila midguts i alle aldre og isolere disse celler til yderligere analyse, såsom næste generation sekventering. Denne kraftfulde metode giver mulighed for at studere de endogene molekylære mekanismer, der er uløseligt forbundet med befolkningens aldring i en beriget population af stamceller eller stamceller. De opnåede data fra disse undersøgelser vil uden tvivl gøre det lettere at identificere konserverede molekyler, der er væsentlige i aldring på tværs af arter.
Den præsenterede protokol beskriver en metode til at isolere individuelle servicekontrakter fra unge og gamle voksne Drosophila midguts, som efterfølgende kan anvendes til yderligere molekylære analyser såsom næste generation sekventering. FAC sortering af GFP-positive cellepopulation fra ESG -Gal4 har UAS-GFP fluelinen allerede nået ved flere grupper 21,22. Men indtil nu er tilstedeværelsen af de to forskellige toppe af GFP-positive celler er blevet enten overset eller undervurderet. Vi viser, at denne adskillelse ikke kun repræsenterer to forskellige populationer af celletyper (HTT og EBS), men også, at de to toppe af GFP-positive celler ophold tydeligt adskilt under ældning. Denne observation er yderst relevant og værdifuldt for forskere interesseret i at studere stam- eller progenitorceller under aldring. Isolering af individuelle servicekontrakter fra gamle midguts har været hæmmet af, at der ikke er nogen molekylær markør kombination til at identificere individuelle servicekontrakter i en gammel mellemtarmen. Den eneste markør, unambiguously identificerer individuelle servicekontrakter i en gammel mellemtarmen er phospho-histone3 (PH3), da individuelle servicekontrakter er de eneste delende celler i mellemtarmen 12,13. Men PH3 er et uegnet markør til isolering ISC da antallet af dividere stamceller på ethvert givet tidspunkt er for lav for at opnå en ordentlig mængde ISC for efterfølgende analyser. Fluelinen ESG -Gal4, UAS-GFP er den mest almindelige fluelinen bruges af forskere, der studerer ISC funktion, vedligeholdelse og differentiering. Vores nuværende viden om den molekylære regulering af individuelle servicekontrakter homeostase er baseret på studier, hvor specifikke molekyler og signalveje er blevet manipuleret (revideret i 7). Derfor mangler vi stadig viden om de endogene molekylære forandringer, der sker i løbet af aldring. Den heri beskrevne fremgangsmåde lukker dette hul og er baseret på det faktum, at ISC kan isoleres baseret på deres størrelse, granularitet og GFP intensitet fra voksne midguts på noget tidspunkt under ældning.
Mensoprettelse og optimering af denne metode har vi fundet følgende trin for at være kritisk for en pålidelig resultat. Ca. 200 indvolde skal dissekeret for at opnå en god mængde af ISC for FAC-sortering. Hastigheden af dissektion er afgørende og afhænger af den enkelte praksis. En uddannet person kan dissekere 40 indvolde inden 20-30 min. Da GFP også kommer til udtryk i de Malpighian tubuli i ESG -Gal4, UAS-GFP fluelinen, er det vigtigt helt at fjerne Malpighian tubuli fra mellemtarmen. De dissekerede midguts skal opbevares på et køligt miljø for at undgå vævsnedbrydning og reducere RNAse-aktivitet i vævet. Derfor skal dissekerede midguts overføres fra dissekere fad i mikrocentrifugerør indeholdende kold 1x PBS / 1% BSA opløsning efter maksimalt 20-30 min og holdt på is. Dog bør de dissekerede midguts ikke efterlades på is i mere end 2 timer før start vævet dissociation med trypsin. Den mest efficient tilgang er at dissekere så mange partier af fluer som muligt inden for disse 2 timer, start derefter trypsin fordøje for disse partier. Hvis der er behov for flere midguts, kan de dissekeres under inkubationen tidspunkter af trypsin fordøjelse.
Selvom trypsin er en meget potent enzym og kan have skadelige virkninger på celler, vi stadig fået nok levende, raske celler til efterfølgende FAC sortering. Det afgørende skridt i vores procedure, der giver mulighed for isolering af intakte celler er, at de dissocierede celler fjernes fra trypsinopløsning hver 30 min. Hvis dissekerede midguts inkuberes i 2 ½ time i en trypsin indeholdende opløsning ved stuetemperatur, observerede vi en stigning i døde, Sytox-positive celler 20-30%. Det skal påpeges, at trypsinopløsningen vi bruger indeholder EDTA. Tilstedeværelsen af EDTA sandsynligvis letter væv disintegration ved chelaterende calcium- og magnesiumioner er nødvendige for en korrekt funktion af ekstracellulære matrix-molekyler. </p>
Det mest afgørende skridt til succes sortere HTT fra unge og gamle indvolde er passende indledende indstillinger af FACS og gating parametre via de beskrevne kontroller og efter en konkret sortering hierarki. Vi udførte FAC sortering på en ARIA II flowcytometer (FACSDiva software). Det er vigtigt, at instrumentet er tændt mindst en time før sortering at varme op lasere. Notatet, når FAC sortering af individuelle servicekontrakter udføres for første gang, parametrene for sortering og om erstatning skal indstilles ved hjælp af de førnævnte knapper: (1) dissocierede celler fra vildtype (f.eks w 1118) Drosophila midguts uden tilsætning af Sytox – fastsættelse af denne parameter (trin 4.4.1) forhindrer, sortering celler baseret på deres autofluorescens; (2) dissocierede celler fra vildtype (f.eks w 1118) Drosophila midguts med Sytox tilføjet – at sætte denne parameter(Trin 4.4.2) tillader adskillelse døde fra levende celler (døde celler har en høj autofluorescens og kan forurene de sorterede GFP-positive celler); (3) dissocierede celler fra midguts af ESG -Gal4, UAS-GFP fluelinen uden Sytox – sikrer at sætte denne parameter (trin 4.4.3), at alle GFP-positive celler er plottet i scatter plot. Hvis disse parametre ikke er indstillet korrekt, vil det sorterede cellepopulation sandsynligvis indeholde døde celler og debris (figur 5B, C), mange GFP-positive celler vil blive savnet (figur 5D) og to forskellige toppe for GFP-positive celler som ses i histogram plot vil (figur 2E og figur 3E) ikke påvises. Når FACS og gating parametre er indstillet, instrumentet kalibreret og klar til at sortere celler fra ESG -GAL4, UAS-GFP fluelinen. Da disse parametre kan gemmes, alle fremtidige sortering sessioner for individuelle servicekontrakter og EB'er fra ESG -GAL4, UAS-GFP fluelinen kan starte fra trin 4.5. Selv vælge "renhed" tilstand og udføre en tovejs renhed slags nedsætter antallet af celler sorteret, det giver mulighed for en højere sortering stringens (trin 4.6 og figur 4B, C). Af note, fordelen ved at bruge Sytox stedet for propidiumiodid at mærke døde celler er, at der er kun en lav afsmitning til FITC (GFP) kanal, hvilket gør det let at kompensere for spillover.
Vores metode til at berige for ISC og EB'er henholdsvis er baseret på sortering af celler i henhold til forskellige GFP ekspressionsniveauer. Det kan være, at under ældning af misdifferentiated EB'er også udtrykke GFP på et lavere niveau og kunne forveksles som individuelle servicekontrakter. Da de sorterede celler er også forskellige i størrelse og granularitet, mener vi dog, at vores sortering strategi er den mest velegnede til denne dato for at berige for individuelle servicekontrakter og EB'er. Det er også kendt, at celler i en aldrende mellemtarmen støttemure ISC identitet har en lille kerne 15. For at få mere klarhed om identiteten af de sorterede celler, kunne man sortere celler fra en transgen fluelinen, der bærer ESG -GAL4, UAS-GFP og et Notch signalering reporter transgen. Da Notch har vist sig at være aktive kun EBS 12,13, individuelle servicekontrakter isoleret fra en ung mellemtarmen ville være negativt for Notch reporter, mens EBS vil være positivt for Notch reporter. Men aldrende Notch signalering bliver under afvigende i mellemtarmen væv. Derfor skal det skal testes, om denne eksperimentelle oprettet er faktisk mere pålidelige til at skelne mellem individuelle servicekontrakter og EB'er isoleret fra en gammel mellemtarmen.
Vi har allerede ansat denne tilgang til sammenlignende transkriptom analyse af individuelle servicekontrakter fra unge og gamle midguts og identificeret en række faktorer, der differentielt reguleret under aldring (unpub. Observ.). Desuden er denne metode giver mulighed for at analysere forskelle i genekspression mellem individuelle servicekontrakter og EBS. En sådan undersøgelses vil give indsigt i de oprindelige molekylære ændringer, der forekommer som en celle kommer ind i differentieringsprocessen. Desuden vil isoleringen af EB'er under aldring og efterfølgende analyser belyse de molekylære ændringer af alder-induceret misdifferentiation. Endvidere kan denne metode kombineres med andre genetiske værktøjer, der anvendes i Drosophila at undersøge genfunktion. Sammenfattende denne metode giver en fordomsfri tilgang til at undersøge molekylære karakteristika og ændringer i individuelle servicekontrakter og EB'er under ældning. Dette er et værdifuldt redskab, som vil lette udforskningen af aldrende mekanismer i voksne stamceller og stamceller.
The authors have nothing to disclose.
We are grateful to Gabriele Allies for excellent technical assistance. We thank the University Ulm Medical Faculty for the use of the FACS Core Facility and the Institut für Molekulare und Zelluläre Anatomie for using the confocal microscope. We thank S. Hayashi for the esg-Gal4, UAS-GFP fly line. This project is funded by the Federal Ministry of Education and Research (BMBF, Forschungskern SyStaR). A.T. is supported by SFB 1074 (Project A2). A.T. and G.A. are supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, FE578/3-1). H.M.T. is a member of the International Graduate School in Molecular Medicine Ulm (GSC 270).
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Forceps: Dumont, Inox Biologie #5 | Fine Science Tools | 11252-20 | |
SefarNitex 03-150um/38 (35 µm nylon mesh) | Sefar | 3A03-0150-102-00 | |
Falcon 5ml Round Bottom Polystyrene Test Tube with Cell Strainer Snap Cap | Corning | 352235 | |
Polymax 1040 | Heidolph | 543-42210-00 | |
Albumin from bovine serum (BSA) | Sigma | A4503-50G | |
0.5% Trypsin-EDTA | Invitrogen | 15400-054 | Trypsin obtained from a different company most likely has a different activity and the duration of the trypsin digest has to be adjusted accordingly. |
SYTOX Blue Dead Cell Stain for flow cytometry | Life Technologies | S34857 | |
RNAlater Stabilization Solution | Life Technologies | AM7023 | other solutions, e.g. Trizol can be used for subsequent RNA isolation |
FACSAria II cell sorter | Becton Dickinson | Turn on one hour prior to sorting |