Understanding the endogenous molecular changes in adult stem cells during aging requires isolating the cells of interest. The method described here presents a simple and robust approach to enrich for and isolate Drosophila intestinal stem cells and the enteroblast progenitor cells by FACS at any time point during aging.
Aging tissue is characterized by a continuous decline in functional ability. Adult stem cells are crucial in maintaining tissue homeostasis particularly in tissues that have a high turnover rate such as the intestinal epithelium. However, adult stem cells are also subject to aging processes and the concomitant decline in function. The Drosophila midgut has emerged as an ideal model system to study molecular mechanisms that interfere with the intestinal stem cells’ (ISCs) ability to function in tissue homeostasis. Although adult ISCs can be easily identified and isolated from midguts of young flies, it has been a major challenge to study endogenous molecular changes of ISCs during aging. This is due to the lack of a combination of molecular markers suitable to isolate ISCs from aged intestines. Here we propose a method that allows for successful dissociation of midgut tissue into living cells that can subsequently be separated into distinct populations by FACS. By using dissociated cells from the esg-Gal4, UAS-GFP fly line, in which both ISCs and the enteroblast (EB) progenitor cells express GFP, two populations of cells are distinguished based on different GFP intensities. These differences in GFP expression correlate with differences in cell size and granularity and represent enriched populations of ISCs and EBs. Intriguingly, the two GFP-positive cell populations remain distinctly separated during aging, presenting a novel technique for identifying and isolating cell populations enriched for either ISCs or EBs at any time point during aging. The further analysis, for example transcriptome analysis, of these particular cell populations at various time points during aging is now possible and this will facilitate the examination of endogenous molecular changes that occur in these cells during aging.
En oundviklig konsekvens av att åldras är den minskande förmåga vävnader och organ att förbli funktionella. Adulta stamceller är avgörande för att upprätthålla vävnads homeostas och organfunktioner, men som organismer ålder, stamcellerna upplever också en nedgång i deras biologiska beteende. Detta är särskilt skadligt för vävnader som har en hög omsättningshastighet, såsom tarmepitelet. Kännetecken för åldrade stamceller inkluderar genomisk skador, osäkra mekanismer reparation, nedsatt cellcykelreglering och misregulated signalvägar, som alla påverkar normala stamceller beteende (över i 1-3). Genom att manipulera specifika signalvägar eller knacka ner specifika gener, har vi fått insikt i sina roller i regleringen och upprätthålla normal stamcellsbeteende. Eftersom de flesta av dessa experiment är kandidatmolekyl tillvägagångssätt har vi mycket lite kunskap om de endogena molekylära förändringar som sker i stamceller underåldrande. Ett sätt att närma sig denna fråga är att jämföra transkriptom av unga kontra gamla stamceller för att identifiera molekyler vars uttrycksprofilen förändras väsentligt under åldrandet. Tyvärr har biologiska och tekniska utmaningar hämmas våra framsteg beträffande detta tillvägagångssätt hittills.
Drosophila melanogaster är en mycket lämplig modellorganism för att studera åldrandet eftersom den har en kort livslängd (ca 60-70 dagar) och uppvisar åldrande fenotyper (över i 4). Vidare kan åldrandeprocessen i Drosophila accelereras genom temperaturen. När hålla flugorna vid 29 ° C, kan redan observeras en åldrig fenotyp i tarmvävnaden efter 15 dagar 5. Dessutom är Drosophila mottaglig för en uppsjö av genetiska manipulationer. I synnerhet har Drosophila midgut vuxit fram som ett utmärkt modellsystem för att studera inverkan av olika signalvägar och miljömässiga utmaningar påbiologi tarm stamceller (ISCs) under åldrandet (över i 6-10). Drosophila tarmepitel har en hög omsättningshastighet och förnyas varannan vecka hos kvinnor och ungefär en gång i månaden hos män 11. ISCs bosatt i Drosophila midgut har kapacitet att dela sig och producera en själv förnyad ISC och en post-mitotiska stamceller kallas enteroblast (EB) 12,13. EB skiljer till antingen en absorberande enterocyten eller en sekretorisk enteroendocrine cell. Till detta datum är den enda markör kombination som entydigt märker en ISC uttrycket av transkriptionsfaktorn escargot (ESG) och Notch-liganden Delta (Dl) 14. Men bara gäller detta för en ung och frisk tarm. Under åldrandet, är midgut epitel kännetecknas av en ökning av ISC proliferation 15-17. Dessutom stör avvikande Notch-signalering öde beslut ISC dottercelleroch inducerar misdifferentiation EBS 15. Detta resulterar i en ansamling av celler som är aktiva för Notch-signalering och co-express ESG och Dl och därigenom gör Dl uttryck otillräcklig för att identifiera bona fide stamceller i en åldrig midgut. Svårigheten i att identifiera sanna ISCs har hindrat möjligheten att undersöka endogena förändringar i åldrande ISCs förrän nu.
Vi har tacklat det här problemet genom att dra nytta av ESG -Gal4, UAS-GFP transgen lina där nivån av GFP uttryck i ISCs och EB är annorlunda och förblir annorlunda hela åldrandet. Ett liknande tillvägagångssätt har beskrivits för isolering av larvneuroblaster och nervceller 18,19. Midguts av unga och gamla ESG -Gal4, UAS-GFP flugor dissekerades och dissocieras till enskilda celler. Cellerna sorteras sedan för GFP-positiva celler med användning av fluorescensaktiverad cellsortering (FACS). Intressant, sorterade GFP-positiva calnar fördelade i två distinkta toppar baserade på GFP-fluorescensintensiteten (GFP hög och GFP låg). Dessutom fördelningen av GFP-positiva celler i de två topparna också korrelerade med cellstorlek: cellerna som uppvisade låg GFP intensitet var små och mindre kornig medan celler med hög GFP intensitet var större och mer granulär. Denna observation antydde att de mindre ISCs kunde särskiljas från de större EBS med FACS baserade på GFP intensitet och väljer lämplig framåtspridning (FSC) och sidospridning (SSC) inställningar. Fängslande, förblev de två topparna tydligt avskilt under åldrandet. Dessutom är förhållandet mellan de två topparna förändrats på ett sätt som återspeglar de ovan nämnda kännetecknen för åldrande midguts: nämligen att antalet stora, misdifferentiated EBS ökar över tiden. Från dessa resultat drar vi slutsatsen att vi genom att sortera efter GFP-positiva celler genom att använda lämpliga parameterinställningar FACS kan anrika ISCs och EB som helst led dnder åldrande.
Sammanfattningsvis vi införa en FACS strategi som möjliggör för forskare att berika för två olika cellpopulationer, ISCs och EBS, från Drosophila midguts i alla åldrar och isolera dessa celler för vidare analys, till exempel nästa generations sekvensering. Denna kraftfulla metoden tillåter att studera de endogena molekylära mekanismer som är förbundna med åldrandet i en berikad population av stamceller eller progenitorceller. Data som erhållits från dessa studier kommer otvivelaktigt att underlätta identifieringen av konserverade molekyler som är betydande i åldrandet över arter.
Den presenterade protokoll beskriver en metod för att isolera ISCs från unga och gamla vuxna Drosophila midguts, som sedan kan användas för ytterligare molekylära analyser som nästa generations sekvensering. FAC sortering av GFP-positiva cellpopulation från ESG -Gal4 har UAS-GFP fluglina redan uppnåtts av flera grupper 21,22. Men fram tills nu förekomsten av de två distinkta toppar i GFP-positiva celler har antingen förbises eller undervärderad. Vi visar att denna separation inte bara representerar två olika populationer av celltyper (ISCs och EBS), men också att de två topparna av GFP-positiva celler stanna distinkt separat under åldrandet. Denna observation är mycket relevant och värdefull för forskare som är intresserade av att studera stamceller eller progenitorceller under åldrandet. Isolering av ISCs från gamla midguts har hindrats av det faktum att det inte finns någon molekylär markör kombination för att identifiera ISCs i en åldrig midgut. Den enda markör som unambiguously identifierar ISCs i en gammal midgut är fosfor-histone3 (PH3), eftersom ISCs är de enda delande celler i midgut 12,13. Dock är PH3 ett olämpligt markör för att isolera ISCs eftersom antalet dela stamceller vid varje given tidpunkt är för låg för att få en anständig mängd ISCs för efterföljande analyser. Fluglinan ESG -Gal4, UAS-GFP är den vanligaste linan som används av forskare som studerar ISC-funktion, underhåll och differentiering. Vår nuvarande kunskap på molekylär reglering av ISCs homeostas är baserad på studier där specifika molekyler och signalvägar har manipulerats (över i 7). Därför saknas fortfarande kunskap om de endogena molekylära förändringar som sker under åldrandet. Den häri beskrivna metoden stänger detta gap och är baserad på det faktum att ISCs kan isoleras baserat på deras storlek, granularitet och GFP intensitet från vuxna midguts vid någon tidpunkt under åldrande.
Medanupprättande och optimera denna metod som vi har hittat följande steg för att vara avgörande för en pålitlig utfall. Cirka 200 tarmar måste dissekeras för att erhålla en bra mängd ISCs för FAC sortering. Hastigheten på dissektion är avgörande och beror på individens praxis. En utbildad person kan dissekera 40 tarmar inom 20-30 min. Eftersom GFP uttrycks också i de Malpighian tubuli i ESG -Gal4, är det UAS-GFP fluglina viktigt att helt ta bort de Malpighian tubuli från midgut. De dissekerade midguts måste förvaras i en sval miljö för att undvika vävnadsnedbrytning och minska RNAs aktiviteten i vävnaden. Därför måste de dissekerade midguts överföras från dissekera skålen i mikrocentrifugrör innehållande kallt 1x PBS / 1% BSA lösning efter max 20-30 min och hålls på is. Dock bör de dissekerade midguts inte lämnas på is i mer än 2 timmar innan vävnadsdissociering med trypsin. Den mest efficient tillvägagångssätt är att dissekera så många partier av flugor som möjligt inom dessa 2 timmar, sedan starta trypsin smälta för dessa partier. Om fler midguts behövs, kan de dissekerade under inkubationstider på trypsin digerering.
Även trypsin är en mycket potent enzym och kan ha skadliga effekter på celler, vi fortfarande erhållas tillräckligt levande, friska celler för efterföljande FAC sortering. Nyckelsteget i vårt förfarande som medger isolering av intakta celler är att de dissocierade cellerna avlägsnas från trypsinlösning varje 30 min. Om de dissekerade midguts inkuberas under 2 ½ timme i en trypsin innehållande lösning vid rumstemperatur, observerade vi en ökning av döda, Sytox-positiva celler 20-30%. Det bör påpekas att trypsin lösningen vi använder innehåller EDTA. Närvaron av EDTA underlättar förmodligen vävnad sönderfall genom kelaterande kalcium- och magnesiumjoner som behövs för en korrekt funktion av extracellulära matrixmolekyler. </p>
De mest avgörande steg för att lyckas sortera ISCs från unga och gamla tarmar är lämpliga grundinställningar av FACS och grind parametrar med de beskrivna kontrollerna och efter en viss sorterings hierarki. Vi utförde FAC sortering på en ARIA II flödescytometer (FACSDiva programvara). Det är viktigt att instrumentet slås på minst en timme före sortering för att värma upp lasrarna. Notera, när FAC sortering av ISCs utförs för första gången, de parametrar för sortering och för ersättning måste fastställas med hjälp av de tidigare nämnda kontrollerna: (1) dissocierade celler från vildtypen (t.ex. w 1118) Drosophila midguts utan tillsats av Sytox – ställa in den här parametern (steg 4.4.1) förhindrar sorterings celler baserat på deras autofluorescens; (2) dissocierade celler från vildtypen (t.ex. w 1118) Drosophila midguts med Sytox läggas – ställa in den här parametern(Steg 4.4.2) medger att separera döda från levande celler (döda celler har en hög autofluorescens och kan förorena de sorterade GFP-positiva celler); (3) dissocierade celler från midguts av ESG -Gal4, UAS-GFP fluglina utan Sytox – ställa in den här parametern (steg 4.4.3) ser till att alla GFP-positiva celler plottas i punktdiagrammet. Om dessa parametrar inte är inställda på rätt sätt kommer den sorterade cellpopulationen troligen innehåller döda celler och skräp (figur 5B, C), många GFP-positiva celler kommer att missa (figur 5D) och de två distinkta toppar för GFP-positiva celler som ses i histogrammet tomten (Figur 2E och figur 3E) kommer inte att upptäckas. När FACS och grind parametrar har ställts in, är instrumentet kalibrerat och redo att sortera celler från ESG -GAL4, UAS-GFP fluglina. Eftersom dessa parametrar kan sparas, alla framtida sorterings sessioner för ISCs och EB från ESG -GAL4, UAS-GFP fluglina kan börja från steg 4,5. Även välja "Renhet" läge och utförande av en tvåvägs renhet sortera minskar antalet celler sorterade, möjliggör det en högre sorterings stringens (Steg 4,6 och figur 4B, C). Att notera, är fördelen med att använda Sytox istället för propidiumjodid för att märka döda celler som det finns endast en låg spridningseffekterna på den FITC (GFP) kanal, vilket gör det lätt att kompensera för spillover.
Vår metod att anrika för ISCs och EBS, respektive, är baserad på att sortera celler enligt olika GFP-expressionsnivåer. Det kan vara så att under åldrandet av misdifferentiated EB också uttrycka GFP på en lägre nivå och kan misstas som ISCs. Eftersom de sorterade cellerna skiljer sig också i storlek och kornighet, vi tror att vår sorteringsstrategi är den mest lämpliga för detta datum att anrika ISCs och EBS. Dessutom är det känt att celler i en åldrande midgut snäpp ISC identitet har en liten kärna 15. För att få mer klarhet om vilka de sorterade cellerna kan man sortera celler från en transgen fluglina som bär ESG -GAL4, UAS-GFP och en Notch-signalering reporter transgen. Eftersom Notch har visats vara aktiv endast i EBS 12,13, ISCs isolerad från en ung midgut vore negativt för Notch reporter, medan EBS skulle vara positivt för Notch reporter. Men under åldrandet Notch-signalering blir avvikande i midgut vävnad. Därför måste det testas huruvida detta experimentella inrättat är verkligen mer tillförlitlig att skilja mellan ISCs och EB isolerats från en gammal midgut.
Vi har redan använt denna metod för jämförande transkriptomanalys av ISCs från unga och gamla midguts och identifierat ett antal faktorer som differentiellt regleras under åldrandet (unpub. Observer.). Dessutom ger den här metoden för att analysera skillnader i genuttryck mellan ISCs och EBS. Sådan undersöknings kommer att ge en inblick i de inledande molekylära förändringar som sker som en cell in i differentieringsprocessen. Dessutom kommer isoleringen av EBS under åldrande och efterföljande analyser belysa de molekylära förändringar i ålders inducerad misdifferentiation. Dessutom kan denna metod kombineras med andra genetiska verktyg som används i Drosophila för att studera genfunktion. Sammanfattningsvis erbjuder denna metod en opartisk syn att undersöka molekylära egenskaper och förändringar i ISCs och EB under åldrandet. Detta är ett värdefullt verktyg som underlättar utforskning av åldrande mekanismer hos vuxna stamceller och progenitorceller.
The authors have nothing to disclose.
We are grateful to Gabriele Allies for excellent technical assistance. We thank the University Ulm Medical Faculty for the use of the FACS Core Facility and the Institut für Molekulare und Zelluläre Anatomie for using the confocal microscope. We thank S. Hayashi for the esg-Gal4, UAS-GFP fly line. This project is funded by the Federal Ministry of Education and Research (BMBF, Forschungskern SyStaR). A.T. is supported by SFB 1074 (Project A2). A.T. and G.A. are supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, FE578/3-1). H.M.T. is a member of the International Graduate School in Molecular Medicine Ulm (GSC 270).
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Forceps: Dumont, Inox Biologie #5 | Fine Science Tools | 11252-20 | |
SefarNitex 03-150um/38 (35 µm nylon mesh) | Sefar | 3A03-0150-102-00 | |
Falcon 5ml Round Bottom Polystyrene Test Tube with Cell Strainer Snap Cap | Corning | 352235 | |
Polymax 1040 | Heidolph | 543-42210-00 | |
Albumin from bovine serum (BSA) | Sigma | A4503-50G | |
0.5% Trypsin-EDTA | Invitrogen | 15400-054 | Trypsin obtained from a different company most likely has a different activity and the duration of the trypsin digest has to be adjusted accordingly. |
SYTOX Blue Dead Cell Stain for flow cytometry | Life Technologies | S34857 | |
RNAlater Stabilization Solution | Life Technologies | AM7023 | other solutions, e.g. Trizol can be used for subsequent RNA isolation |
FACSAria II cell sorter | Becton Dickinson | Turn on one hour prior to sorting |