Fractionnement rapide et isolement de composants de sang total dans les échantillons obtenus à partir d'un milieu communautaire
Summary
We outline a methodology for the processing of whole blood to obtain a variety of components for further analysis. We have optimized a streamlined protocol that enables rapid, high-throughput simultaneous processing of whole blood samples in a non-clinical setting.
Abstract
Collecte et traitement des échantillons de sang entier dans un cadre non clinique offre une occasion unique d'évaluer les personnes vivant dans la communauté à la fois avec et sans conditions préexistantes. Le traitement rapide de ces échantillons est essentiel pour éviter la dégradation des composants cellulaires clés. Inclus ici sont des méthodes pour simultanée périphérique cellules mononucléaires du sang (CMSP), l'ADN, l'ARN et l'isolement de sérum provenant d'un simple prélèvement de sang effectué dans les maisons des participants consentants dans une région métropolitaine, avec la transformation engagées dans les 2 heures de la collecte. Nous avons utilisé ces techniques pour traiter plus de 1.600 échantillons de sang rendement, des matériaux de haute qualité constante, qui a ensuite été utilisé dans succès méthylation de l'ADN, le génotypage, l'expression génique et la cytométrie en flux analyses. Certaines des méthodes employées sont la norme; Cependant, lorsqu'ils sont combinés de la manière décrite, ils permettent un traitement efficace des échantillons provenant de participants Population- et / ou communautaireétudes fondées qui ne seraient normalement pas être évaluées dans un cadre clinique. Par conséquent, ce protocole a le potentiel d'obtenir des échantillons (données) et par la suite qui sont plus représentatives de la population générale.
Introduction
De multiples études ont caractérisé les différences d'expression génique, méthylation de l'ADN et de sous-ensemble de cellules dans le sang chez les personnes avec et sans mentale (ou autre) des maladies 1-4. Ces études, cependant, ont été obtenus à partir des paramètres cliniques dans lesquels les différences associées à des maladies peuvent être amplifiées en raison de la nature généralement plus sévère des maladies pour lesquelles les patients sont à la recherche de traitement. Grâce aux progrès de «omiques» les approches, la dernière décennie a vu une explosion d'intérêt pour obtenir des échantillons biologiques à partir de paramètres épidémiologiques 5-7 communauté et / ou, dans le but de fournir des estimations fondées sur la population de prévalence de la maladie et une image plus large de la déterminants environnementaux de ces maladies mentales et / ou physiques.
Un défi clé à cet égard est l'obligation pour le traitement rapide des échantillons prélevés. La dégradation des cellules mononucléaires, des composants du système immunitaire qui sont frequentl clésy utilisé pour évaluer la santé d'un individu, commence immédiatement après la prise de sang avec une diminution significative de la récupération après 2 heures de la collecte 8-10. Pour relever ce défi, nous présentons un protocole optimisé dans lequel de multiples composants de sang humain entier sont simultanément isolés à partir d'échantillons obtenus dans les maisons de sujets vivant dans une grande région métropolitaine. Le protocole est basé sur notre compilation et la modification des techniques actuelles, y compris le stockage de toutes les fractions «extra» dans le cas des techniques futures permettent davantage d'isolement / analyse. Bien que les méthodes ou des kits de remplacement peuvent être utilisés à la place des méthodes individuelles décrites ici, ceux décrits se sont révélés être un moyen fiable et efficace pour le traitement des échantillons de manière à haut débit. Fractions de haute qualité (CMSP, l'ADN, sérum, et ARN) de sang frais peuvent être produites dans les 2 heures de collecte et de tous les spécimens d'analyse prêts peuvent être disponibles dans les 2 jours (Figure 1).
Ce protocole a été développé pour permettre le traitement efficace des échantillons prélevés dans la communauté-logement, les résidents adultes de la ville de Detroit pour les essais dans le Health Study Quartier Detroit (DNHS; DA022720, RC1MH088283, DA022720-05-S1), un repose-population étude des déterminants sociaux et biologiques du trouble de stress post-traumatique (SSPT) et d'autres maladies mentales. La prévalence du SSPT dans Detroit est plus de deux fois la moyenne nationale 11,12. Identifier les déterminants biologiques de stress post-traumatique dans cette population peut aider à développer pharmacologique approprié et / ou interventions cognitivo-comportementales pour aider ceux qui souffrent de la maladie, à la fois dans cette population urbaine, et dans d'autres populations à haut risque (par exemple, le retour des vétérans militaires). Notre laboratoire, précédemment situé à Wayne State University de Detroit, au Michigan, a été choisi pour le traitement basée sur notre expertise dans la manipulation des échantillons de tissus frais dérivés d'une variétédes sources, la nécessité de commencer à traiter les échantillons dans les 2 heures de la collecte, et notre proximité avec les sites de collecte. Avec cette occasion unique à portée de main, notre objectif était d'optimiser le traitement pour le plus grand rendement de l'ADN, l'ARN, le sérum et des cellules mononucléées du sang périphérique (CMSP) de chaque spécimen (un total de N = 1.639 échantillons de plus de 5 vagues de collecte de l'échantillon). Les procédures décrites ici peuvent être effectuées simultanément dans un cadre non-clinique, produisant ainsi un matériau (voir le tableau 1 pour les rendements moyens) de départ pour une multitude d'applications en aval, y compris microréseau, épigénétique, en temps réel RT-PCR et cytométrie de flux analyses.
Figure 1. flux de travail global. Le processus global représenté ici comprend la logistique de l'obtention des échantillons de sang de l'identification partic consentantspants au sang se dessinent. De haute qualité, des fractions (cellules mononucléaires du sang périphérique; PBMC, de l'ADN, le sérum, et de l'ARN) de sang entier frais peut être produite à l'intérieur de 2 heures et collecte tous les échantillons d'essai en main peut être disponible dans les 2 jours. En outre, les fractions préparées par ce procédé conviennent pour le stockage à long terme ne sont pas si les échantillons à tester immédiatement. L'ensemble du calendrier décrite ici pourrait être achevée en une seule journée (~ 5 h total). Cependant, une telle journée serait extrêmement laborieux surtout pour un seul technicien avec expérience considérable avec les techniques. Ainsi, nous recommandons de diviser les procédures le jour 1 entre au moins deux techniciens et l'achèvement du traitement de l'ARN du Jour 2. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous avons décrit un protocole simplifié qui a été appliquée avec succès pour traiter plus de 1.600 échantillons de sang total dans l'étude de la santé Detroit Quartier. Bien que nombre de ces techniques sont disponibles dans la littérature existante, notre compilation étape par étape, y compris les modifications chronométrés précisément entre chaque étape, reflète une optimisée, le protocole efficace qui produit avec succès une variété de spécimens biologiques avec une large gamme d'appli…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank Henriette Mair-Meijers for invaluable attention to detail and hours devoted to processing the blood collections. We are grateful for the graphic design expertise of Natalie Jameson Kiesling. We also appreciate the approval of the manufacturers (Qiagen (Valencia, CA), BD Biosciences (San Jose, CA), Life Technologies (Grand Island, NY)) mentioned herein to publish the use of their products as described. Funding for this work was generously provided by the National Institutes of Health award numbers DA022720, RC1MH088283, and DA022720-05-S1.
Materials
| QIAamp DNA Blood Mini Kit | Qiagen | 51104 | Day 1: DNA isolation |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma | P5493-1L | Day 1: PBMC isolation |
| 5 ¾” Pasteur pipets | Fisher | 13-678-6A | Day 1: PBMC isolation |
| Fetal Bovine Serum (FBS), heat inactivated | Life Technologies | 10082147 | Day 1: PBMC isolation |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma | D8418-500ml | Day 1: PBMC isolation |
| RPMI Medium 1640, liquid | Invitrogen | 11875119 | Day 1: PBMC isolation |
| 0.4% trypan blue stain | Invitrogen | T10282 | Day 1: PBMC isolation |
| Countess Cell Counting Chamber | Invitrogen | C10283 | Day 1: PBMC isolation |
| Countess Automated Cell Counter or cell counting device such as a microscope and hemocytometer | Invitrogen | C10281 | Day 1: PBMC isolation |
| LeukoLOCK Fractionation & Stabilization Kit | Ambion | 1933 | Day 1: Leukocyte RNA isolation |
| 25G x 5/8 in. needles | Becton Dickinson | 305122 | Day 1: Leukocyte RNA isolation |
| Syringes (5ml) | Becton Dickinson | 309646 | Days 1 and 2: Leukocyte RNA isolation |
| Denaturing Lysis Solution | Ambion | 8540G | Day 2: Leukocyte RNA isolation |
| 5M NaCl | Life Technologies | 24740011 | Day 2: Leukocyte RNA isolation |
| TRI Reagent | Ambion | 9738 | Day 2: Leukocyte RNA isolation |
| Bromo-3-chloro-propane (BCP) | Sigma | B-9673 | Day 2: Leukocyte RNA isolation |
| spin cartridges | Ambion | 10051G | Day 2: Leukocyte RNA isolation |
| 0.1mM EDTA | Ambion | 9912 | Day 2: Leukocyte RNA isolation |
| DNA-free Kit | Ambion | AM1960 | Day 2: DNase treament |
| RNA 6000 Ladder | Agilent | 5067-1529 | Day 2: Bioanalyzer analysis |
| RNA 6000 Nano Series II Kit | Agilent | 5067-1511 | Day 2: Bioanalyzer analysis |
| RNaseZAP | Ambion | AM8782 | Day 2: Bioanalyzer analysis |
| Ethanol >99% | Sigma | E7023-500ml | |
| Isopropanol >99% | Sigma | I9516-500ml | |
| Nuclease-free ultra pure water | Invitrogen | 9938 | |
| Pipette tips (nuclease-free) | Eppendorf | 22491253 | |
| Pipetter (serological) | Eppendorf | 2223020-4 | |
| Pipetters (for volumes under 1ml) | Eppendorf | 3120000-054 | |
| Pipettes (serological) | Fisher | 13-678-27E | |
| Controlled rate freezing containers | Nalgene | 5100-0001 | |
| Cryoboxes (to hold 2ml and 5ml cryovials and 1.5ml microcentrifuge tubes) | Fisher | 03-395-464 | |
| Test tube rack | Thermo Scientific | 14-804-134 | |
| 15ml polypropylene tubes | Fisher | 14-959-49D | |
| 1.5ml and 0.65 microcentrifuge tubes | Fisher | 07-200-534 and 07-200-185 | |
| 2ml and 5ml cryovials | Fisher | 10-500-26 and 10-269-88F | |
| 8ml CPT vacutainer | BD Biosciences | 362761 | 2 tubes |
| 6ml K2 EDTA vacutainer | BD Biosciences | 367863 | 2 tubes |
| 8.5ml SST vacutainer | BD Biosciences | 367988 | 1 tube |
| Vortexer | Fisher | 2215365 | |
| Dry bath incubator with heating block for microcentrifuge tubes | Fisher | 11-715-1250 | |
| Filtration/vacuum system for use within the cell culture hood | Fisher | 01-257-87 | |
| Fixed-angle rotor for microcentrifuge tubes with aerosol-tight lid | Eppendorf | 22637002 | |
| Refrigerated centrifuge with a swing-bucket rotor and aerosol-tight caps for 16 x 125mm vacutainers and 15ml polypropylene tubes | Eppendorf | 22628157 | 2, one does not need to be refrigerated |
| Nanodrop 2000 (recommended for accuracy of small volumes) or other spectrophotometric device | Fisher | 13-400-411 | |
| Agilent Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2940CA | |
| Liquid nitrogen tank | Thermo Scientific | 11-676-56 | |
| -80 ˚C freezer | Thermo Scientific | 992RAK | |
| Sharps container | Fisher | 22-037-970 | |
| Biological waste container | Thermo Scientific | 1223P52 | |
| Biosafety Level 2 certified cell culture hood | Thermo Scientific | 13-261-315 |
References
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