Candida albicans biofilm développement sur ​​les organismes étrangères médicalement pertinents dans une souris modèle sous-cutanée Suivi par bioluminescence Imaging

Résumé

Nous présentons une procédure expérimentale de développement du biofilm de Candida albicans dans un modèle sous-cutané de souris. Les biofilms fongiques ont été quantifiés en déterminant le nombre d’unités formant des colonies et par une imagerie de bioluminescence non invasive, où la quantité de lumière produite correspond au nombre de cellules viables.

Résumé

Candida albicans développement de biofilm sur des surfaces biotiques et / ou abiotiques représente une menace spécifique pour les patients hospitalisés. Jusqu'à présent, C. biofilms albicans ont été étudiés principalement in vitro, mais il ya un besoin crucial pour une meilleure compréhension de ce processus dynamique dans des conditions in vivo. Nous avons développé un modèle de rat sous-cutanée in vivo pour étudier C. albicans formation de biofilm. Dans notre modèle, multiple (jusqu'à 9) appareils infectés par Candida sont implantés à la partie arrière de l'animal. Cela nous donne un avantage majeur sur le système de modèle de cathéter veineux central car il nous permet d'étudier plusieurs biofilms indépendants dans un animal. Récemment, nous avons adapté ce modèle pour étudier C. le développement de biofilm albicans chez la souris BALB / c. Dans ce modèle, mûrir C. biofilms albicans développent dans les 48 heures et démontrent l'architecture du biofilm tridimensionnelle typique. La quantification de biofilm fongiqueest traditionnellement analysé post-mortem et exige le sacrifice d'accueil. Parce que cela nécessite l'utilisation de nombreux animaux pour réaliser des études cinétiques, nous avons appliqué la bioluminescence imagerie non invasive (BLI) de suivre longitudinalement dans vivo mûrir C. albicans biofilms développer dans notre modèle sous-cutanée. C. albicans cellules ont été modifiées pour exprimer le gène de la luciférase de Gaussia princeps (Gluc) fixée à la paroi cellulaire. Le signal de bioluminescence est produite par la luciférase qui convertit la coelentérazine de substrat ajouté à la lumière qui peut être mesurée. Le signal BLI ressemblait nombre de cellules obtenues à partir de cathéters explantées. Imagerie non invasive pour quantifier la formation de biofilm in vivo fournit des applications immédiates pour le dépistage et la validation de médicaments antifongiques dans des conditions in vivo, ainsi que pour les études basées sur les interactions hôte-pathogène et contribuant à une meilleure compréhensiontion de la pathogenèse des infections liées aux cathéters.

Introduction

Candida albicans est un organisme commensal, qui se trouve à différents sites d'individus en bonne santé, par exemple sur la peau ou en tant que partie de la flore vaginale et gastro-intestinal. Cependant, dans hospitalisé, et surtout les patients immunodéprimés, il peut provoquer un large éventail d'infections ^1. Chez ces individus, le système immunitaire est affaibli permet aux cellules de Candida pour diffuser dans la circulation sanguine et envahissent les tissus profonds provoquant des infections potentiellement mortelles. En outre, la présence de substrats abiotiques tels que des cathéters veineux centraux et des voies urina....

Protocole

NOTE: Toutes les expériences animales ont été approuvés par le comité d'éthique de la KU Leuven (numéro de projet 090/2013). Maintenir les animaux conformément aux lignes directrices de soins aux animaux KU Leuven.

1. C. albicans Croissance

1. Vingt-quatre heures avant le début de l'expérience animale, préparer des boîtes de YPD en ajoutant 10 g d'extrait de levure de granules, 20 g de peptone bactériologique, et 15 g d'agar granulé. Maquillage volume à 900 ml avec de l'eau Milli-Q et autoclave.
2. Ajouter 50 ml de 40% de glucose stérile. Bien mélanger et verser dans des boîtes de Pétri. Laissez....

Résultats

Dans cette étude, nous montrons la procédure chirurgicale d'implant de cathéter et explant in vivo au cours de C. albicans développement du biofilm dans une souris. En outre, nous affichons la quantification des biofilms matures non seulement par UFC recensement classique mais aussi par BLI.

Comme le montre la Figure 1A, phosphorescents non morceaux de cathéters en polyuréthanne ont été coupés en des dispositifs de 1 cm et ensuite revêtus avec du sérum........

Discussion

L'utilisation de modèles animaux, et en particulier les modèles rongeurs, pour les études réservés aux biofilms microbiens est très important que le système immunitaire de l'hôte est un facteur essentiel dans la formation de biofilm que les modèles in vitro ne peuvent pas expliquer. Dans cette étude, nous décrivons un sous-cutanée C. relativement simple biofilm modèle de la souris albicans, qui peut être facilement adopté dans un laboratoire de recherche et ne nécessite pas de compéten.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Extrait de levure granulé	Merck	MERC1.03753.0500
Peptone bactériologique	Oxoid	LP037B
Gélose granulée	Difco	214530
D-(+)-glucose	Fluka	49159-5KG
Saline tamponnée au phosphate  ;	Préparé en laboratoire		pour 1 L de 10x PBS : 80 g de NaCl, 2 g de KCl, 14,4 g de Na2HPO4, 2,4 g de KH2PO4
>RPMI1640 avec de la L-glutamine et sans carbonate de sodium.	Sigma	R6504-1L	Préparer selon le protocole pour les tests de sensibilité aux médicaments contre Candida albicans  ;
Acide 3-(N-morpholino)propanesulfonique (MOPS)	Sigma	M1254	MOPS est utilisé pour ajuster le pH du milieu RPMI (pH 7,0)
sérum fœtal bovin (FBS)	Sigma	F7524
Tube de cathéter intraveineux en polyuréthane tripe-lumière (2,4 mm de diamètre, Certofix Trio S730)  ;	BBraun	CV-15703	Pièce en polyuréthane coupée en morceaux de 1 cm
Dexaméthasone	Fagron SAS, France	611139	Immunosuppresseur (solution mère 10 mg/ml)
Ampicilline  ;	Duchefa Biochemie, Pays-Bas	A0104	Prophylaxie antibactérienne
Kétamine 1000	Pfizer	804 119	Anesthésique
Domitor	Pfizer	134737-1	Anesthésique
Antisedan	Pfizer	134783-2	Inversion de l’anesthésie
Gel de xylocaïne (2 %) - c’est Linisol	AstraZeneca	352 1206	Anesthésique local pour la peau
		ophtalmique Terramycine/polymyxine-b	Pour prévenir le dessèchement et l’infection des yeux
Coelentérazine	Prolume (Nanolight)	NF-CTZ-FB	Agent sensible à la lumière (doit être conservé dans l’obscurité)
Isopropanol d’iode (1 %)	3M&trade ; DuraPrep&trade ;   ;		Désinfectant pour la peau
0,5 % de chlorhexidine dans de l’alcool à 70 %.   ;	Cedium		Désinfectant pour la peau
Équipement
Chambre de comptage
Seringues à insuline (0,3 ml)	Terumo Myjector 29G	324826	Pour injection de coelenterazine
Rasoir			Pour petits animaux
Outils chirurgicaux			stériles Ciseaux, 2 paires de pinces à épiler,
scalpel Coussin chauffant	Leica	14042321474
Suture cutanée	Johnson& Johnson	K890H	Fil chirurgical, aiguille
d’eau Sonicateur	Branson 2210
BLI caméra (IVIS Spectrum)  ;	Perkin Elmer, Alameda	IVISSPE
Living Image software  ;	Perkin Elmer, Alameda		(version 4.2)  ;

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