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Neurosciences

신경 세포 유형의 표면에 대한 유동 세포 계측법 프로토콜 및 세포 내 항원 분석

Published: December 18, 2014
doi:
10.3791/52241
, , , ,
1Emmy Noether-Group for Stem Cell Biology, Department of Molecular Embryology, Institute of Anatomy and Cell Biology,University of Freiburg, 2Spemann Graduate School of Biology and Medicine and Faculty of Biology,University of Freiburg, 3School of Life Sciences,Keele University, 4Center for Biological Signaling Studies (BIOSS),University of Freiburg

Summary

We provide a detailed description of a protocol for flow cytometric analysis of surface antigens and/or intracellular antigens in neural cell types. Critical aspects of experimental planning, step-by-step methodological procedures, and fundamental principles of flow cytometry are explained in order to enable neurobiologists to exploit this powerful technology.

Abstract

Flow cytometry has been extensively used to define cell populations in immunology, hematology and oncology. Here, we provide a detailed description of protocols for flow cytometric analysis of the cluster of differentiation (CD) surface antigens and intracellular antigens in neural cell types. Our step-by-step description of the methodological procedures include: the harvesting of neural in vitro cultures, an optional carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-labeling step, followed by surface antigen staining with conjugated CD antibodies (e.g., CD24, CD54), and subsequent intracellar antigen detection via primary/secondary antibodies or fluorescently labeled Fab fragments (Zenon labeling). The video demonstrates the most critical steps. Moreover, principles of experimental planning, the inclusion of critical controls, and fundamentals of flow cytometric analysis (identification of target population and exclusion of debris; gating strategy; compensation for spectral overlap) are briefly explained in order to enable neurobiologists with limited prior knowledge or specific training in flow cytometry to assess its utility and to better exploit this powerful methodology.

Introduction

유동 세포 계측법 광범위 고유의 분산 특성, 세포 표면 항원의 발현 및 기타 형광 매개 변수 1-3을 통해 세포 집단을 정의 할 수 면역학, 혈액학 및 종양학에 악용되고있다. 혈통 개발 및 질병에 우리의 통찰력은 초기 구현 4,5 후이 방법의 지속적인 정제 상당한 정도의 결과입니다. 흐름의 양적 및 전반적인 분석 가능성의 증가에 대한 인식은 세포 계측법 최근 줄기 세포 연구에서의 더 광범위한 사용을 권장하고 짧은 시간 프레임 (6)의 유사 깊은 진행을 가능하게 할 수있다. 그러나, 구체적으로는 신경 개체군을 분석 및 분리하는 유동 세포 계측법의 적용은 긴 도전로 인식되어왔다. 자연적 현탁액에 존재 조혈 세포와 대조적으로, 신경 세포 유형은 전형적 신경교 다양한 O를 포함 할 수있다 지나치게 복잡한 출처 수확거기는 주변 세포뿐만 아니라 공정 함유 신경 세포의 복잡한 네트워크. 따라서, 신경 생물학 매일 연구 루틴의 완전한 잠재력을 유동 세포 계측법의 다양성을 구현하기 위해 아직있다. 그러나 신경 생물학에서 분석 레퍼토리 중요한 요소로 간주 될 수있는 한 가능한 단일 세포 현탁액을 생성 할 수있다 (그리고 프로토콜 그 목적 7 고안 및 최적화 된)로 유동 세포 계측법, 형광 – 활성화 된 세포 (FACS)를 정렬 8-11.

그림 1
. 유체 공학, 광학 및 전자 제품 : 유세포 분석 및 유세포의 구성 요소도 1 원리 유동 세포 계측기는 세 가지 시스템을 포함한다. 현탁액 세포의 효율적인 흐름은 시스 flui하여 수행됩니다 (기본 조직 또는 체외 배양에서 준비)유체 역학을 통해 D는 중앙 코어 샘플을 제한, 집중. 광학 부품은 적절한 검출기에 신호를 지향 세포 및 광학 필터 스트림을 조명 레이저로 구성된다. 전자 신호, 이후 컴퓨터에 의해 처리 및 데이터 분석 및 게이팅 모니터에 가시화로 변환 검출 된 광 신호를 출력합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

사이토의 빌딩 블록을 포함하는 기본 원리의 적어도 기본적인 이해에서 유세포 방법 이익의 사용자 (검토를 위해 12, 13 참조; 또한 그림 1 참조). 레이저 빔은 다시 '단일 파일'잇달아되는 레이저 빔을 통과 현탁액 중의 세포를 포함하는 유체 역학적 유체 스트림 중점과 교차. intercepti이 심문 포인트에서 빛의 산란에 레이저 결과 셀 (또는 그 문제에 대해 다른 입자)의에. (상기 입자 / 세포의 granulosity 반사 측면 스 캐터) 산란광뿐만 아니라 그 수직 방향 (입자의 크기와 연관된 순방향 산란) 레이저의 연속 방향으로 검출 할 수있다. 이러한 상기 분산 특성은 (또한 또는 세포 파편, 기포 등) 레이블이없는 샘플이 일반적으로 초기 게이팅에 사용되는 측면 산포도 대 이변 앞으로 분산에 신호 (이벤트)를 생성합니다 왜 특정 표시를 필요로하지 않는다. 적절한 레이저와 대응 여기 및 방출 스펙트럼에 대한 특정 필터를 사용함으로써, 전지의 양성, 강도의 정도, 또는 형광 마커의 유무에 대해 분석 할 수있다. 유세포 애플리케이션의 대부분은 세포 표면 항원을 통해 특성화에 초점을 맞추고있다. 조혈 lineag 달리E는 신경 혈통은 표면 항원의 발현 패턴에 따른 5 이하 광범위하게 정의 남아있다. 표면 항원을 이용하는 장점 중 하나는 생균 그러한 FACS 소팅 같은 패러다임을 전지에 실시 될 수 있다는 것이다. 대조적으로, 세포 내 항원 염색 가능한 세포를 필요로 다운 스트림 응용 프로그램을 배제, 항원 – 항체 상호 작용을 중재하는 고정 및 투과성으로 단계가 필요합니다. 참고로, 이러한 접근 방식은 여전히 다수의 정량 분석 (14)뿐만 아니라 RNA와 단백질 식 (15)에 대한 다운 스트림 분석을 위해 수 있습니다. 혈액학, 면역학 및 종양학는 종종 특정 하위 집단 (16)을 정의하기 위해 함께 십여 마커를 사용했습니다. 또한, 질량 계측법 또는 CyTOF 해주기 30 파라미터 (17, 18)까지 동시에 분석하기 위해 사용될 수있다.

신경 줄기 세포 응용 프로그램뿐만 아니라 차 문화 14,19,20 세포의 이질성에 들어시험관은 일반적인 현상 21-23이다. 관심의 표적 집단을 대표하지 셀 (24, 25)에 대한 판독 실험 잠재적 교란 요인을 구현. 편리하게는, 이종 세포 현탁액 내에 존재하는 다른 셀룰러 서브 세트들은 이러한 다양한 집단을 정의하는데 이용 될 수있는 고유 한 (또는 아직 공지 해독 함) 항원 발​​현 프로파일을 부담. 생물 의학 응용을 촉진, 따라서 이에, 세포 이질성 해결에 중요한 역할을 할 수 있습니다 유동 세포 계측법 (체외 분석, 세포 치료)와 가장 관련성이 높은 일부 (24, 26)에 초점을 맞춤으로써 양적 판독을 최적화 할 수 있습니다. 다양한 표면 항원 조합은 특정 신경 세포 유형의 정량 및 아이솔레이션을 허용하도록 지난 몇년 동안에 확인되었다. 이 신경줄 기세포 27 NSC의 절연을위한 CD15 / CD24 / CD29 표면 항원의 결합, differentia의 농축을 위해 CD133를 포함테드 신경 세포와 신경 능선 세포 (28) 또는 CD15 / CD24 / CD44 / CD184 / CD271 다른 서명 (29, 30) 중 신경과 신경 교세포 부분 집합 (25)을 분리합니다. 신경을 넘어, 아교 마커는 A2B5 (31), CD44 (25), NG2 32 GLAST (33)를 포함한다. 최근 출판물은 파킨슨 세포 이식에 도파민 전구 물질에 대한 풍부하게 중뇌 floorplate 전구체 마커 코린 34, 35을 36 패러다임 악용하고있다. CD 분자 마커 만 아니지만, 세포 – 세포 상호 작용 및 세포의 능력을 기능적으로 중요한 매개체 외 매트릭스 분자로부터 큐에 대응하는 37과 성장 인자. 상기 신경 계통 개발 조합을 특성화하기 위해 CD 항원 아스날 향상 전략 중 하나는 관심있는 특정 세포 유형에 대해 CD 항원의 조합을 스크리닝하고 정의하는 것으로 알려진 세포 마커를 사용하는 것이다. 우리는 최근에 이러한 접근 방식을 이용하고 CD4를 확인했다9 층 – / CD200 신경을 분화 유도 만능 줄기 세포 배양 시스템 (38)에서 신경 세포의 부분 집합을 풍부하게하기위한 새로운 접근 방식으로 높은 조합 발현 패턴. 여기서 우리는 포함하고 후자 프로토콜 (및 그 선택의 변화)하는 표면의 얼룩 및 세포 내 염색 유동 세포 계측법에 의해 신경 세포의 부분 집단을 정의하는 동시에 사용할 수 있습니다에 대해 설명합니다.

그림 2
실험 프로토콜 옵션도 2의 흐름도. 도면은 프로토콜에 관련된 주요 단계의 개략도를 도시한다. 선택 단계 (CFSE 염료 또는 세포 내 항원 라벨)은 밝은 회색 상자로 표시됩니다. 수확 후에, 세포 표면 염색 전에 신경 세포 현탁액의 생존율 및 세포 수를 평가하기 위해 필수적이다. 긍정적으로뿐만 아니라 음성 대조군의 관심 샘플 이외에 포함 할 필요가있다. 샘플은 유세포 분석에 의해 분석 및 / 또는 셀 정렬 패러다임에서 사용할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

우리는 이전에 세포 내 염색 (38)에 대한 이차 항체와 함께 일차 항체를 사용 하였지만, 이제시켜 세포 조작 (39)의 단계를 줄이고, 약간 변형 형광의 Fab 단편 (제논 라벨링)을 통해 차 항체의 비공유 라벨링을 소개한다. 또한, 프로토콜의 다양성의 또 다른 예로서, 우리는 항원 염색 전에 표면 숙신 이미 딜 에스터 (CFSE)를 카르복시로 실험 한 서브 세트의 선택적 표지를 사용한다. 이러한 사전 CFSE 표지는 두 세포주 또는 실험 조건의 직접 비교를 즉시 (수대 CFSE 표지. 하나의 샘플 튜브, 분산 또는 배양 시간의 미묘한 차이를 줄이고 항체를 절약 이내) 레이블. CFSE (41, 42)는 일반적으로 증식 및 바코드 실험 43, 44에서, 트래킹 셀 (40)에 사용되는 확립 된 형광 염료이다. 실제 정렬 단계 (FACS, 면역 자기 세포 분리 또는 immunopanning)이이 프로토콜의 일부가 아닌 상태에서 마지막으로, 원칙적으로, 여기에 설명 된 수확 및 라벨 절차는 항원 또는 세포 내 라벨 기반의 정렬 응용 프로그램을 표면에 노출 될 수 수율 샘플을 15 25, 28.

이 기사로, 우리는 목표 : 같은 세포 내 CFSE 염료 라벨 단계 조립 방법을 제시, 세포 내 표적의 탐지를위한 프로토콜뿐만 아니라 결합 된 표면과 세포 내 항원 분석 (38)를 요약, 실행 가능한 표면 항원 염색 프로토콜 25, 28을 요약 COM에 대한 실험 옵션parative 신경 세포 집단의 분석, 유세포 분석 (데이터 전략 및 프리젠 테이션 (47)을 적절한 게이팅 컨트롤을 13,46) 흐름 방식을 요약한다.

Protocol

1. 신경 세포 수확 현미경에 의해 평가 : 실험을 개시하기 전에, 시야 또는 위상차 현미경으로 배양 상태를 확인한다. 참고 : 해부에서 얻은 주 신경 조직이지만, 원칙적으로 동등하게 의무 유세포 분석 14,28 흐름에, 프로토콜의 초점은 체외 신경 세포 시스템에서 얻은 세포에주의하시기 바랍니다. 수확 세포 7 : 부드럽게 2+에…

Representative Results

여기에 제시된 프로토콜은 다양한 실험 방법 (그림 2) 수 있습니다. 최단 버전에서는, 그것이 표면 항원의 간단한 염색 가이드 간주 될 수있다 (1, 3, 6 단계). 그것의 더 복잡한 형태에있어서, 세포 내 항원의 범위 공동 라벨 패러다임의 수는 (2 및 / 또는 4~5 선택적 단계) 추구 될 수있다. 또한, CFSE 표지 단계는 세포 – 세포 상호 작용 연?…

Discussion

여기에 제시된 프로토콜은 물론 인간 줄기 세포로부터 유도 된 신경 세포 배양 확립되어 있지만, 동일하게 주 조직 또는 신경 세포주를 포함하는 다른 신경 세포 소스에 적용될 수있다. 배아 공급원 이외에, 신경 줄기 세포 또는 전구 성인 뇌 신경 인성 (27)의 영역으로부터 추출 될 수있다. 또한, 유동 세포 계측법 및 FACS는 성숙한 뉴런 (54), 아스트로 글 리아 (33), 미세 아교…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Our research program is funded through the Emmy Noether-Program of the German Research Foundation (DFG), grant PR1132/3-1. Further support by the Müller-Fahnenberg Foundation of the University of Freiburg is gratefully acknowledged. This study was supported in part by the Excellence Initiative of the German Research Foundation (GSC-4, Spemann Graduate School).

Materials

DMEM/F12 (1:1) (Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12) Life Technologies 11330057 www.lifetechnologies.com
DPBS without Ca2+ Mg2+ Life Technologies 14190169 www.lifetechnologies.com
Fetal bovine serum, qualified, E.U.-approved, South America origin (FBS) Life Technologies 10270-106 www.lifetechnologies.com
MEM Non-essential amino acids (100 x) Life Technologies 11140035 www.lifetechnologies.com
TrypLE Express Life Technologies 12604013 www.lifetechnologies.com
Trypan blue solution, 0.4% Life Technologies 15250061 www.lifetechnologies.com
Paraformaldehyde Carl Roth 335.3 www.carlroth.com
Bovine serum albumin (BSA) Fraction V PAA Laboratories, Coelbe K41-001 www.gelifesciences.com
Tween-20 Detergent Calbiochem 655205 www.merckmillipore.de
Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) eBioscience 65-0850-84 www.ebioscience.com
DMSO AppliChem A1584 www.applichem.com
Bottle top filters express plus 0.22 µm, 250 ml Millipore SCGPU02RE www.millipore.com
Cell culture treated flasks (T 25) NUNC 156367 www.thermoscientific.com
Cell culture treated flasks (T 75) NUNC 156499 www.thermoscientific.com
Conical tubes (15 ml) Greiner Bio-One 188271 www.greinerbioone.com
Conical tubes (50 ml) Greiner Bio-One 227261 www.greinerbioone.com
Pasteur pipet, glass (150 mm) STEIN Labortechnik, Remchingen S03710150 www.stein-labortechnik.de
Pipet tips (0.1-10 µl) Corning 4125 www.corning.com
Pipet tips (1-200 µl) Corning 4126 www.corning.com
Pipet tips (100-1000 µl) Corning 4129 www.corning.com
Serological pipets, 5 ml Corning 4051 www.corning.com
Serological pipets, 10 ml Corning 4101 www.corning.com
Serological pipets, 25 ml Corning 4251 www.corning.com
Microcentrifuge tubes (0.5 ml) Sarstedt 72,699 www.sarstedt.com
Microcentrifuge tubes (1.5 ml) Greiner Bio-One 616201 www.greinerbioone.com
Microcentrifuge tubes (2.0 ml) Sarstedt 72,695,500 www.sarstedt.com
Anti-Human CD24 APC monoclonal antibody eBioscience 17-0247-42 www.ebioscience.com
Working dilution 1:50
Anti-Human CD54 PE monoclonal antibody eBioscience 12-0549-42 www.ebioscience.com
Working dilution 1:50
Neuronal Class III β-Tubulin (Tuj1) polyclonal antibody Covance PRB-435P www.covance.com
Working dilution 1:2000
Alexa Fluor 488 Donkey anti Rabbit Life Technologies A21206 www.lifetechnologies.com
Working dilution 1:2000
Zenon® Fluorescein Rabbit IgG Labeling Kit Life Technologies Z-25342 www.lifetechnologies.com
Neubauer-Improved counting chamber Marienfeld 0640010 www.marienfeld-superior.com
Vortex Scientific Industries G560E www.scientificindustries.com
Thermomixer comfort Eppendorf 5355 000.001 www.eppendorf.com
Accuri C6 flow cytometer Becton Dickinson (BD) 653118 www.bdbiosciences.com/instruments/accuri
Microcentrifuge refrigerated, PerfectSpin 24 R Peqlab 91-PSPIN-24R www.peqlab.de
Orbital shaker, Unimax 1010 Heidolph 543-12310-00 www.heidolph-instruments.de
Centrifuge refrigerated, Rotanta 96 RC Hettich 4480-50 www.hettichlab.com
Class II Biological safety cabinet Safe 2020 Thermo Scientific 51026640 www.thermoscientific.com
CO2 Incubator, Heracell 240i Thermo Scientific 51026331 www.thermoscientific.com
Vacuum system, Vacusafe comfort Integra Biosciences 158320 www.integra-biosciences.de
Microscope, Axiovert 40 CFL Zeiss 451212 www.zeiss.de
Pipet controller, accu-jet pro Brand 26303 www.brand.de
Micropipet, Pipetman neo P20N (2-20 µl) Gilson F144563 www.gilson.com
Micropipet, Pipetman neo P200N (20-200 µl) Gilson F144565 www.gilson.com
Micropipet, Pipetman neo P1000N (100-1000 µl) Gilson F144566 www.gilson.com
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Citer Cet Article
Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. Flow Cytometry Protocols for Surface and Intracellular Antigen Analyses of Neural Cell Types. J. Vis. Exp. (94), e52241, doi:10.3791/52241 (2014).
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