Flow Cytometry Protocols for Surface and Intracellular Antigen Analyses of Neural Cell Types

Vishal Menon; Ria Thomas; Arun R. Ghale; Christina Reinhard; Jan Pruszak

doi:10.3791/52241

JoVE Journal > Neuroscience

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Neurosciences

التدفق الخلوي بروتوكولات لالسطحية وبين الخلايا مستضد تحليلات العصبية أنواع الخلايا

Published: December 18, 2014

doi:

10.3791/52241

Vishal Menon, Ria Thomas², Arun R. Ghale³, Christina Reinhard, Jan Pruszak⁴

¹Emmy Noether-Group for Stem Cell Biology, Department of Molecular Embryology, Institute of Anatomy and Cell Biology,University of Freiburg, ²Spemann Graduate School of Biology and Medicine and Faculty of Biology,University of Freiburg, ³School of Life Sciences,Keele University, ⁴Center for Biological Signaling Studies (BIOSS),University of Freiburg

Summary

We provide a detailed description of a protocol for flow cytometric analysis of surface antigens and/or intracellular antigens in neural cell types. Critical aspects of experimental planning, step-by-step methodological procedures, and fundamental principles of flow cytometry are explained in order to enable neurobiologists to exploit this powerful technology.

Abstract

Flow cytometry has been extensively used to define cell populations in immunology, hematology and oncology. Here, we provide a detailed description of protocols for flow cytometric analysis of the cluster of differentiation (CD) surface antigens and intracellular antigens in neural cell types. Our step-by-step description of the methodological procedures include: the harvesting of neural in vitro cultures, an optional carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-labeling step, followed by surface antigen staining with conjugated CD antibodies (e.g., CD24, CD54), and subsequent intracellar antigen detection via primary/secondary antibodies or fluorescently labeled Fab fragments (Zenon labeling). The video demonstrates the most critical steps. Moreover, principles of experimental planning, the inclusion of critical controls, and fundamentals of flow cytometric analysis (identification of target population and exclusion of debris; gating strategy; compensation for spectral overlap) are briefly explained in order to enable neurobiologists with limited prior knowledge or specific training in flow cytometry to assess its utility and to better exploit this powerful methodology.

Introduction

التدفق الخلوي تم استغلاله على نطاق واسع في علم المناعة، أمراض الدم والأورام لتعريف السكان الخلية عن طريق الخصائص الذاتية مبعثر، سطح الخلية مستضد التعبير، والمعلمات مضان أخرى ^1-3. لدينا رؤى في التنمية نسب الدم والمرض نتيجة لذلك إلى درجة كبيرة من التحسين المتواصل لهذه المنهجية بعد ^4،5 التنفيذ الأولي. زيادة الوعي بإمكانيات التحليلية الكمية والشاملة للالتدفق الخلوي وشجعت في الآونة الأخيرة استخدام أكثر على نطاق واسع في أبحاث الخلايا الجذعية وربما تمكن من التقدم عميق مشابه في إطار زمني أقصر ^6. ومع ذلك، منذ فترة طويلة ينظر إلى تطبيق التدفق الخلوي لتحليل تحديدا وعزل السكان العصبي كما تحديا. وعلى النقيض من الخلايا المكونة للدم التي توجد بشكل طبيعي في التعليق، وعادة ما تحصد أنواع الخلايا العصبية من مصادر معقدة بشكل مفرط التي قد تشمل الدبقية ومختلف سذر الخلايا المحيطة فضلا عن شبكة معقدة من الخلايا العصبية الحاملة للعملية. ونتيجة لذلك، بيولوجيا الأعصاب لم يتم بعد تنفيذ براعة التدفق الخلوي إلى إمكانية كاملة في الروتين الأبحاث اليومية. ومع ذلك، ما دام يمكن أن تتولد تعليق خلية واحدة قابلة للحياة (ووقد وضعت بروتوكولات والأمثل لهذا الغرض ^7)، التدفق الخلوي ومضان تنشيط الخلايا الفرز (FACS) يمكن اعتباره عنصرا قيما للذخيرة التحليلية في علم الأعصاب ^8-11.

تشمل الشكل 1. مبدأ تحليل تدفق cytometric ومكونات تدفق عداد الكريات تدفق cytometers ثلاثة أنظمة رئيسية: FLUIDICS، والبصريات والإلكترونيات. وتدفق انسيابي من الخلايا في تعليق (المعد من الأنسجة الابتدائية أو في الثقافة المختبر) والذي أنجزه flui غمدد عبر الهيدروديناميكية التركيز، وتقييد عينة لالأساسية وسطها. وتتكون الأجزاء البصرية من الليزر التي تضيء تيار الخلايا والمرشحات الضوئية التي توجه إشارة إلى كشف المناسبة. الإشارات الضوئية وتحويلها إلى إشارات إلكترونية، ومعالجتها في وقت لاحق من قبل الحاسوب وتصور على شاشة لتحليل البيانات والنابضة الكشف عنها. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

مستخدمي تدفق cytometric أساليب الربح من على الأقل فهم أساسي من أساسيات الأساسية بما في ذلك كتل بناء على عداد الكريات (على مراجعة نرى ^12،13؛ وكذلك انظر الشكل 1). شعاع ليزر يتقاطع مع تيار فلويديك تركز hydrodynamically الذي يحتوي على الخلايا في تعليق، والتي بدورها تمر عبر شعاع ليزر في "ملف واحد" واحدا تلو الآخر. وinterceptiعلى خلية (أو أي جسيم آخر، لهذه المسألة) مع نتائج الليزر في تشتيت الضوء من هذه النقطة الاستجواب. يمكن الكشف عن الضوء المتناثرة في استمرار للاتجاه ليزر (مبعثر إلى الأمام، ويرتبط مع حجم الجسيمات)، وكذلك عمودي على اتجاهه (الجانب مبعثر، مما يعكس كتلة تحببية من الجسيمات / خلية). هذه الخصائص المذكورة آنفا مبعثر لا تتطلب وضع العلامات معين، وهذا هو السبب عينة غير المسماة (أو كما البقايا الخلوية، وفقاعات الهواء، وغيرها) سوف تولد إشارة (الحدث) على مبعثر إلى الأمام ذات المتغيرين مقابل الجانب مؤامرة مبعثر تستخدم عادة لالنابضة الأولي. باستخدام أشعة الليزر والمرشحات محددة لالمقابلة الإثارة وانبعاث أطياف المناسبة، يمكن تحليل زنزانة لمدة الإيجابية لها، ومستوى شدة، أو عدم وجود علامات الفلورسنت. وقد ركزت معظم التطبيقات تدفق cytometric على توصيف عبر مستضدات سطح الخلية. وخلافا للlineag المكونة للدمالبريد، ظلت النسب العصبي تعريف أقل على نطاق واسع وفقا لأنماط سطح حاتمة التعبير ^5. ميزة واحدة من استغلال المستضدات السطحية هي أن الخلايا الحية يمكن أن يتعرض إلى الخلية فرز نماذج مثل FACS. في المقابل، الخلايا مستضد تلطيخ يتطلب تثبيت وpermeabilization خطوات للتوسط في التفاعل حاتمة الأجسام المضادة، مما يحول دون التطبيقات المصب التي تتطلب خلايا قابلة للحياة. وتجدر الإشارة أن هذه النهج لا تزال تسمح للعديد من المقايسات الكمية ¹⁴ وكذلك التحليلات المصب لRNA والبروتين التعبير ^15. أمراض الدم والمناعة والأورام غالبا ما تستخدم أكثر من اثني عشر علامات بالتزامن معينة لتحديد المجموعات السكانية الفرعية ^16. بالإضافة إلى ذلك، الخلوي كتلة أو CyTOF ويمكن الآن أن تستخدم لتحليل ما يصل إلى 30 في وقت واحد المعلمات ^17،18.

لتطبيقات الخلايا الجذعية العصبية وكذلك الثقافات الأولية ^14،19،20 عدم تجانس الخلايا فيالمختبر هو ظاهرة شائعة ^21-23. الخلايا لا يمثلون السكان المستهدفين من الفائدة تجسد عاملا يحتمل الخلط لقراءات تجريبية ^24،25. مريح، ومجموعات فرعية الخلوية المختلفة الحالية داخل الخلية تعليق غير متجانسة تتحمل متميزة (المعروف أو لم يتم بعد فك رموز) لمحات مستضد التعبير، والتي يمكن استخدامها لتحديد هؤلاء السكان المختلفة. التدفق الخلوي يمكن بالتالي تلعب دورا حاسما في حل عدم التجانس الخلوية، وبالتالي، وتسهيل التطبيقات الطبية الحيوية (في المختبر المقايسات، العلاج بالخلايا) وتحسين قراءات الكمية من خلال التركيز على مجموعة فرعية الأكثر صلة ^24،26. وقد تم تحديد مختلف مجموعات المستضد السطحي على مدى السنوات القليلة الماضية للسماح للالكميات وعزل أنواع معينة الخلايا العصبية. وهذا يشمل CD133 لإثراء الخلايا الجذعية العصبية ^27، وهو مزيج من CD15 / CD24 / CD29 المستضدات السطحية لعزل مجلس الأمن القومي، فارقتيد الخلايا العصبية والخلايا العصبية قمة ²⁸ أو CD15 / CD24 / CD44 / CD184 / CD271 لعزل العصبية ومجموعات فرعية الدبقية ^25، بين التوقيعات أخرى ^29،30. ما وراء الخلايا العصبية، وتشمل علامات الدبقية A2B5 ^31، CD44 ^25، NG2 ³² و ³³ GLAST. لقد استغلت ونشر مؤخرا في الدماغ المتوسط floorplate السلائف علامة CORIN ^34،35 لإثراء لالسلائف الدوبامين في زرع الخلايا باركنسون نماذج ^36. جزيئات CD ليست علامات فقط، ولكن الوسطاء ذات الصلة وظيفيا من التفاعلات خلية خلية وقدرة الخلية على الاستجابة للمنبهات من جزيئات المصفوفة خارج الخلية وعوامل النمو ^37. واحد استراتيجية زيادة تعزيز ترسانة من مستضدات CD اندماجي لتوصيف تنمية النسب العصبية هي استخدام علامات داخل الخلايا المعروفة للكشف عن وتحديد مجموعات مستضد CD لنوع معين من الخلايا الفائدة. لقد استغلت مؤخرا مثل هذا النهج وحددت CD49F ^– / CD200 ^عالية أنماط التعبير اندماجي كما نهجا جديدا لتخصيب مجموعات فرعية من الخلايا العصبية متباينة العصبي المحفزة أنظمة زراعة الخلايا الجذعية ^38. هنا، نحن وتشمل ومناقشة البروتوكول الأخير (والاختلافات اختياري منها) التي تلطيخ السطح وتلطيخ الخلايا يمكن استخدامها في وقت واحد لتحديد المجموعات السكانية الفرعية الخلايا العصبية عن طريق التدفق الخلوي.

الشكل 2. مخطط تدفق من الخيارات بروتوكول التجريبية. يصور هذا الرقم التمثيل التخطيطي من الخطوات الرئيسية المشاركة في البروتوكول. يشار إلى الخطوات الاختيارية (صبغ CFSE أو وضع العلامات مستضد الخلايا) من قبل صناديق رمادي فاتح. بعد الحصاد، فمن الضروري لتقييم جدوى وخلية عدد من الايقاف الخلية العصبية قبل تلطيخ سطح الخلية. بالايجابيكذلك تحتاج ضوابط السلبية ليتم تضمينها بالإضافة إلى عينات من الفائدة. ويمكن تحليل عينات عن طريق تحليل تدفق cytometric و / أو استخدامها في الخلية فرز النماذج. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

ولئن كنا قد استخدمت سابقا الأجسام المضادة الأولية في تركيبة مع الأجسام المضادة الثانوية لتلطيخ الخلايا ^38، ونحن الآن إدخال العلامات غير التساهمية من الأجسام المضادة الأولية عبر شظايا فاب فلوري (وضع العلامات زينون) باعتباره اختلاف طفيف، مما يقلل من الخطوات من التلاعب خلية ^39. وعلاوة على ذلك، كمثال آخر على براعة البروتوكول، ونحن توظيف ووضع العلامات اختياري من المجموعة الثانوية التجريبية واحدا تلو carboxyfluorescein استر succinimidyl (CFSE) قبل سطح المستضد تلطيخ. هذا CFSE قبل وضع العلامات يمكن المقارنة الفورية المباشرة اثنين من خطوط الخلايا أو الظروف التجريبية (CFSE المسمى مقابل. ليس لها علامة) داخل أنبوب عينة واحدة، والحد من التباين أو الفروق الدقيقة في فترة حضانة وتوفير الأجسام المضادة. CFSE هو صبغة الفلورسنت الراسخة التي يشيع استخدامها لتتبع خلية ^40، في انتشار ^41،42 والمتوازية التجارب ^43،44. وأخيرا، في حين أن الخطوات الفعلية الفرز (FACS، فصل الخلية immunomagnetic أو immunopanning) ليست جزءا من هذا البروتوكول، من حيث المبدأ، وإجراءات الحصاد ووضع العلامات الموضحة هنا تفعل عينات العائد الذي يمكن أن يتعرض إلى السطح antigen- أو داخل الخلايا التطبيقات الفرز القائم على الوسم ^{15 25،28.}

لهذه المادة، ونحن نهدف إلى: تلخيص سطح قابل للتطبيق بروتوكول مستضد تلطيخ ^25،28، تلخيص بروتوكول للكشف عن الأهداف داخل الخلايا وكذلك سطح مجتمعة وتحليل مستضد الخلايا ^38، تهيئ داخل الخلايا CFSE وضع العلامات صبغ خطوة ^41،45 بوصفه الخيار التجريبي لكومparative يحلل للسكان الخلية العصبية، وتلخيص مناهج تحليل تدفق cytometric (الضوابط المناسبة ^13،46، النابضة استراتيجية والبيانات العرض التقديمي ^47).

Protocol

1. العصبية حصاد خلية التقييم من قبل المجهر: قبل الشروع في التجربة، تحقق من حالة من الثقافة مع مشرق الميدان أو النقيض من المرحلة المجهري. ملاحظة: على الرغم من الأنسجة ?…

Representative Results

بروتوكول المقدمة هنا يسمح للنهج التجريبية تنوعا (الشكل 2). في أقصر نسختها (الخطوات 1 و 3 و 6)، فإنه يمكن أن يعتبر دليلا لتلطيخ بسيط من المستضدات السطحية. في شكله أكثر تعقيدا، وعدد من نماذج التعاون لوضع العلامات مع مجموعة من مستضدات ال?…

Discussion

يتم تأسيس بروتوكول المعروضة هنا بشكل جيد للمزارع الخلايا العصبية المشتقة من الخلايا الجذعية البشرية، ولكن يمكن أن تطبق على قدم المساواة مع غيرها من مصادر الخلايا العصبية بما في ذلك الأنسجة الابتدائية أو خطوط الخلايا العصبية. بالإضافة إلى مصادر الجنينية، الخلايا ال…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Our research program is funded through the Emmy Noether-Program of the German Research Foundation (DFG), grant PR1132/3-1. Further support by the Müller-Fahnenberg Foundation of the University of Freiburg is gratefully acknowledged. This study was supported in part by the Excellence Initiative of the German Research Foundation (GSC-4, Spemann Graduate School).

Materials

DMEM/F12 (1:1) (Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12)	Life Technologies	11330057	www.lifetechnologies.com
DPBS without Ca²⁺ Mg²⁺	Life Technologies	14190169	www.lifetechnologies.com
Fetal bovine serum, qualified, E.U.-approved, South America origin (FBS)	Life Technologies	10270-106	www.lifetechnologies.com
MEM Non-essential amino acids (100 x)	Life Technologies	11140035	www.lifetechnologies.com
TrypLE Express	Life Technologies	12604013	www.lifetechnologies.com
Trypan blue solution, 0.4%	Life Technologies	15250061	www.lifetechnologies.com
Paraformaldehyde	Carl Roth	335.3	www.carlroth.com
Bovine serum albumin (BSA) Fraction V	PAA Laboratories, Coelbe	K41-001	www.gelifesciences.com
Tween-20 Detergent	Calbiochem	655205	www.merckmillipore.de
Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)	eBioscience	65-0850-84	www.ebioscience.com
DMSO	AppliChem	A1584	www.applichem.com
Bottle top filters express plus 0.22 µm, 250 ml	Millipore	SCGPU02RE	www.millipore.com
Cell culture treated flasks (T 25)	NUNC	156367	www.thermoscientific.com
Cell culture treated flasks (T 75)	NUNC	156499	www.thermoscientific.com
Conical tubes (15 ml)	Greiner Bio-One	188271	www.greinerbioone.com
Conical tubes (50 ml)	Greiner Bio-One	227261	www.greinerbioone.com
Pasteur pipet, glass (150 mm)	STEIN Labortechnik, Remchingen	S03710150	www.stein-labortechnik.de
Pipet tips (0.1-10 µl)	Corning	4125	www.corning.com
Pipet tips (1-200 µl)	Corning	4126	www.corning.com
Pipet tips (100-1000 µl)	Corning	4129	www.corning.com
Serological pipets, 5 ml	Corning	4051	www.corning.com
Serological pipets, 10 ml	Corning	4101	www.corning.com
Serological pipets, 25 ml	Corning	4251	www.corning.com
Microcentrifuge tubes (0.5 ml)	Sarstedt	72,699	www.sarstedt.com
Microcentrifuge tubes (1.5 ml)	Greiner Bio-One	616201	www.greinerbioone.com
Microcentrifuge tubes (2.0 ml)	Sarstedt	72,695,500	www.sarstedt.com
Anti-Human CD24 APC monoclonal antibody	eBioscience	17-0247-42	www.ebioscience.com Working dilution 1:50
Anti-Human CD54 PE monoclonal antibody	eBioscience	12-0549-42	www.ebioscience.com Working dilution 1:50
Neuronal Class III β-Tubulin (Tuj1) polyclonal antibody	Covance	PRB-435P	www.covance.com Working dilution 1:2000
Alexa Fluor 488 Donkey anti Rabbit	Life Technologies	A21206	www.lifetechnologies.com Working dilution 1:2000
Zenon® Fluorescein Rabbit IgG Labeling Kit	Life Technologies	Z-25342	www.lifetechnologies.com

Neubauer-Improved counting chamber	Marienfeld	0640010	www.marienfeld-superior.com
Vortex	Scientific Industries	G560E	www.scientificindustries.com
Thermomixer comfort	Eppendorf	5355 000.001	www.eppendorf.com
Accuri C6 flow cytometer	Becton Dickinson (BD)	653118	www.bdbiosciences.com/instruments/accuri
Microcentrifuge refrigerated, PerfectSpin 24 R	Peqlab	91-PSPIN-24R	www.peqlab.de
Orbital shaker, Unimax 1010	Heidolph	543-12310-00	www.heidolph-instruments.de
Centrifuge refrigerated, Rotanta 96 RC	Hettich	4480-50	www.hettichlab.com
Class II Biological safety cabinet Safe 2020	Thermo Scientific	51026640	www.thermoscientific.com
CO₂ Incubator, Heracell 240i	Thermo Scientific	51026331	www.thermoscientific.com
Vacuum system, Vacusafe comfort	Integra Biosciences	158320	www.integra-biosciences.de
Microscope, Axiovert 40 CFL	Zeiss	451212	www.zeiss.de
Pipet controller, accu-jet pro	Brand	26303	www.brand.de
Micropipet, Pipetman neo P20N (2-20 µl)	Gilson	F144563	www.gilson.com
Micropipet, Pipetman neo P200N (20-200 µl)	Gilson	F144565	www.gilson.com
Micropipet, Pipetman neo P1000N (100-1000 µl)	Gilson	F144566	www.gilson.com

References

Herzenberg, L. A., et al. The History and Future of the Fluorescence Activated Cell Sorter and Flow Cytometry: A View from. 48 (10), 1819-1827 (2002).
Chattopadhyay, P. K., Roederer, M. Cytometry: today’s technology and tomorrow’s horizons. Methods (San Diego, Calif). 57 (3), 251-258 (2012).
Jaye, D. L., Bray, R. A., Gebel, H. M., Harris, W. A. C., Waller, E. K. Translational applications of flow cytometry in clinical practice). J. Immunol. 188 (10), 4715-4719 (2012).
Henel, G., Schmitz, J. Basic Theory and Clinical Applications of Flow Cytometry. Lab Med. 38 (7), 428-436 (2007).
Seita, J., Weissman, I. L. Hematopoietic stem cell: self-renewal versus differentiation. Wiley Interdiscip. Rev. Syst. Biol. Med. 2 (6), 640-653 (2010).
Ulrich, H., Bocsi, J. Phenotypes of stem cells from diverse origin. Cytometry. A. 77 (1), 6-10 (2010).
Panchision, D. M., et al. Optimized flow cytometric analysis of central nervous system tissue reveals novel functional relationships among cells expressing CD133, CD15, and CD24. Stem cells. 25 (6), 1560-1570 (2007).
Meyer, R. A., Zaruba, M. E., McKhann, G. M. Flow cytometry of isolated cells from the brain. Anal. Quant. Cytol. 2 (1), 66-74 (1980).
Junger, H., Junger, W. G. CNTF and GDNF, but not NT-4, support corticospinal motor neuron growth via direct mechanisms. Neuroreport. 9 (16), 3749-3754 (1998).
McLaren, F. H., Svendsen, C. N., Vander Meide, P., Joly, E. Analysis of neural stem cells by flow cytometry: cellular differentiation modifies patterns of MHC expression. J. Neuroimmunol. 112 (1-2), 35-46 (2001).
Wang, S., Roy, N. S., Benraiss, A., Goldman, S. A. Promoter-based isolation and fluorescence-activated sorting of mitotic neuronal progenitor cells from the adult mammalian ependymal/subependymal. 22 (1-2), 167-176 (2000).
Tanke, H. J., vander Keur, M. Selection of defined cell types by flow-cytometric cell sorting. Trends Biotechnol. 11 (2), 55-62 (1993).
Baumgarth, N., Roederer, M. A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping. J. Immunol. Methods. 243 (1-2), 77-97 (2000).
Sergent-Tanguy, S., Chagneau, C., Neveu, I., Naveilhan, P. Fluorescent activated cell sorting (FACS): a rapid and reliable method to estimate the number of neurons in a mixed population. J. Neurosci. Methods. 129 (1), 73-79 (2003).
Ernst, A., et al. Neurogenesis in the striatum of the adult human brain. Cell. 156 (5), 1072-1083 (2014).
Perfetto, S. P., Chattopadhyay, P. K., Roederer, M. Seventeen-colour flow cytometry: unravelling the immune system. Nat. Rev. Immunol. 4 (8), 648-655 (2004).
Bandura, D. R., et al. Mass cytometry: technique for real time single cell multitarget immunoassay based on inductively coupled plasma time-of-flight mass spectrometry. Anal. Chem. 81 (16), 6813-6822 (2009).
Bendall, S. C., et al. Single-cell mass cytometry of differential immune and drug responses across a human hematopoietic continuum. Science. 332 (6030), 687-696 (2011).
Neveu, I., Rémy, S., Naveilhan, P. The neuropeptide Y receptors, Y1 and Y2, are transiently and differentially expressed in the developing cerebellum. Neurosciences. 113 (4), 767-777 (2002).
Pruszak, J., Just, L., Isacson, O., Nikkhah, G. Isolation and culture of ventral mesencephalic precursor cells and dopaminergic neurons from rodent brains. Curr. Protoc. Stem Cell Biol. 2 (Unit 2D.5), (2009).
Suslov, O. N., Kukekov, V. G., Ignatova, T. N., Steindler, D. A. Neural stem cell heterogeneity demonstrated by molecular phenotyping of clonal neurospheres. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (22), 14506-14511 (2002).
Bez, A., et al. Neurosphere and neurosphere-forming cells: morphological and ultrastructural characterization. Brain Res. 993 (1-2), 18-29 (2003).
Pruszak, J., Isacson, O. Molecular and cellular determinants for generating ES-cell derived dopamine neurons for cell therapy. Adv. Exp. Med. Biol. 651, 112-123 (2009).
Carson, C. T., Aigner, S., Gage, F. H. Stem cells: the good, bad and barely in control. Nat. Med. 12 (11), 1237-1238 (2006).
Yuan, S. H., et al. Cell-surface marker signatures for the isolation of neural stem cells, glia and neurons derived from human pluripotent stem cells. PloS One. 6 (3), e17540 (2011).
Roy, N. S., Cleren, C., Singh, S. K., Yang, L., Beal, M. F., Goldman, S. Functional engraftment of human ES cell-derived dopaminergic neurons enriched by coculture with telomerase-immortalized midbrain astrocytes. Nat. Med. 12 (11), 1259-1268 (2006).
Uchida, N., et al. Direct isolation of human central nervous system stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97 (26), 14720-14725 (2000).
Pruszak, J., Ludwig, W., Blak, A., Alavian, K., Isacson, O. CD15, CD24, and CD29 define a surface biomarker code for neural lineage differentiation of stem cells. Stem Cells. 27 (12), 2928-2940 (2009).
Peh, G. S. -. L., Lang, R. J., Pera, M. F., Hawes, S. M. CD133 expression by neural progenitors derived from human embryonic stem cells and its use for their prospective isolation. Stem Cells Dev. 18 (2), 269-282 (2009).
Golebiewska, A., Atkinson, S. P., Lako, M., Armstrong, L. Epigenetic landscaping during hESC differentiation to neural cells. Stem Cells. 27 (6), 1298-1308 (2009).
Dietrich, J., Noble, M., Mayer-Proschel, M. Characterization of A2B5+ glial precursor cells from cryopreserved human fetal brain progenitor cells. Glia. 40 (1), 65-77 (2002).
Nishiyama, A. NG2 cells in the brain: a novel glial cell population. Hum. Cell. 14 (1), 77-82 (2001).
Jungblut, M., et al. Isolation and characterization of living primary astroglial cells using the new GLAST-specific monoclonal antibody ACSA-1. Glia. 60 (6), 894-907 (2012).
Ono, Y., et al. Differences in neurogenic potential in floor plate cells along an anteroposterior location: midbrain dopaminergic neurons originate from mesencephalic floor plate cells. Development. 134 (17), 3213-3225 (2007).
Chung, S., et al. ES cell-derived renewable and functional midbrain dopaminergic progenitors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (23), 9703-9708 (2011).
Doi, D., et al. Isolation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Dopaminergic Progenitors by Cell Sorting for Successful Transplantation. Stem Cell Reports. 2 (3), 337-350 (2014).
Solozobova, V., Wyvekens, N., Pruszak, J. Lessons from the embryonic neural stem cell niche for neural lineage differentiation of pluripotent stem cells. Stem Cell Rev. 8 (3), (2012).
Turaç, G., et al. Combined flow cytometric analysis of surface and intracellular antigens reveals surface molecule markers of human neuropoiesis. PloS One. 8 (6), e68519 (2013).
Buchwalow, I. B., Böcker, W. Chapter 2. Immunohistochemistry: Basics and Methods. , 9-17 (2010).
Tario, J. D., et al. Optimized staining and proliferation modeling methods for cell division monitoring using cell tracking dyes. J. Vis. Exp. (70), e4287 (2012).
Lyons, A. B., Parish, C. R. Determination of lymphocyte division by flow cytometry. J. Immunol. Methods. 171 (1), 131-137 (1994).
Hawkins, E. D., et al. Measuring lymphocyte proliferation, survival and differentiation using CFSE time-series data. Nat. Protoc. 2 (9), 2057-2067 (2007).
Quah, B. J. C., Parish, C. R. The use of carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) to monitor lymphocyte proliferation. J. Vis. Exp. 44, (2010).
Sukhdeo, K., et al. Multiplex flow cytometry barcoding and antibody arrays identify surface antigen profiles of primary and metastatic colon cancer cell lines. PloS One. 8 (1), e53015 (2013).
Jiang, L., et al. Daucosterol promotes the proliferation of neural stem cells. The J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 140, 90-99 (2014).
Hulspas, R., et al. Considerations for the control of background fluorescence in clinical flow cytometry. Cytometry. B. 76 (6), 355-364 (2009).
Moloney, M., Shreffler, W. G. Basic science for the practicing physician: flow cytometry and cell sorting. Annals of Allergy, Asthm., & Immunology: Official Publication of the American College of Allergy, Asthma., & Immunology. 101 (5), 544-549 (2008).
Siebzehnrubl, F. A., et al. Isolation and characterization of adult neural stem cells. Methods Mol. Biol. 750, 61-77 (2011).
Guez-Barber, D., et al. FACS purification of immunolabeled cell types from adult rat brain). J. Neurosci. Methods. 203 (1), 10-18 (2012).
Tham, C. -. S., Lin, F. -. F., Rao, T. S., Yu, N., Webb, M. Microglial activation state and lysophospholipid acid receptor expression. Int. J. Dev. Neurosci. 21 (8), 431-443 (2003).
Nguyen, H. X., Beck, K. D., Anderson, A. J. Quantitative assessment of immune cells in the injured spinal cord tissue by flow cytometry: a novel use for a cell purification method. J. Vis. Exp. (50), e2698 (2011).
Marchenko, S., Flanagan, L. Counting human neural stem cells. J. Vis. Exp. (7), 262 (2007).
Brunlid, G., Pruszak, J., Holmes, B., Isacson, O., Sonntag, K. C. Immature and neurally differentiated mouse embryonic stem cells do not express a functional Fas/Fas ligand system. Stem Cells. 25 (10), 2551-2558 (2007).
Brewer, G. J. Isolation and culture of adult rat hippocampal neurons. J. Neurosci. Methods. 71 (2), 143-155 (1997).
Cardona, A. E., Huang, D., Sasse, M. E., Ransohoff, R. M. Isolation of murine microglial cells for RNA analysis or flow cytometry. Nat. Protoc. 1 (4), 1947-1951 (2006).
Nielsen, J. A., Maric, D., Lau, P., Barker, J. L., Hudson, L. D. Identification of a novel oligodendrocyte cell adhesion protein using gene expression profiling. J. Neurosci. 26 (39), 9881-9891 (2006).
Daneman, R., et al. The mouse blood-brain barrier transcriptome: a new resource for understanding the development and function of brain endothelial cells. PloS One. 5 (10), e13741 (2010).
Gräbner, R., Till, U., Heller, R. Flow cytometric determination of E-selectin, vascular cell adhesion molecule-1, and intercellular cell adhesion molecule-1 in formaldehyde-fixed endothelial cell monolayers. Cytometry. 40 (3), 238-244 (2000).
Quah, B. J. C., Parish, C. R. New and improved methods for measuring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo using CFSE-like fluorescent dyes. J. Immunol. Methods. 379 (1-2), 1-14 (2012).
Lathia, J. D., et al. High-throughput flow cytometry screening reveals a role for junctional adhesion molecule a as a cancer stem cell maintenance factor. Cell Rep. 6 (1), 117-129 (2014).
Ganat, Y. M., et al. Identification of embryonic stem cell-derived midbrain dopaminergic neurons for engraftment. J. Clin. Invest. 122 (8), 2928-2939 (2012).
Hedlund, E., et al. Embryonic stem cell-derived Pitx3-enhanced green fluorescent protein midbrain dopamine neurons survive enrichment by fluorescence-activated cell sorting and function in an animal model of Parkinson’s disease. Stem Cells. 26 (6), 1526-1536 (2008).
Maroof, A. M., et al. Directed differentiation and functional maturation of cortical interneurons from human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 12 (5), 559-572 (2013).
Chivet, M., Hemming, F., Pernet-Gallay, K., Fraboulet, S., Sadoul, R. Emerging role of neuronal exosomes in the central nervous system. Front. Physiol. 3, 145 (2012).
Graner, M. W., et al. Proteomic and immunologic analyses of brain tumor exosomes. FASEB J. 23 (5), 1541-1557 (2009).
Eldh, M., Lötvall, J. Isolation and characterization of RNA-containing exosomes. J. Vis. Exp. (59), e3037 (2012).
Capela, A., Temple, S. LeX is expressed by principle progenitor cells in the embryonic nervous system, is secreted into their environment and binds Wnt-1. Dev. Biol. 291 (2), 300-313 (2006).
Nieoullon, V., Belvindrah, R., Rougon, G., Chazal, G. mCD24 regulates proliferation of neuronal committed precursors in the subventricular zone. Mol. Cell. Neurosci. 28 (3), 462-474 (2005).
Nagato, M., et al. Prospective characterization of neural stem cells by flow cytometry analysis using a combination of surface markers. J. Neurosci. Res. 80 (4), 456-466 (2005).
Hall, P. E., Lathia, J. D., Miller, N. G. A., Caldwell, M. A., French-Constant, C. Integrins are markers of human neural stem cells. Stem Cells. 24 (9), 2078-2084 (2006).
Hargus, G., et al. Differentiated Parkinson patient-derived induced pluripotent stem cells grow in the adult rodent brain and reduce motor asymmetry in Parkinsonian rats. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (36), 15921-15926 (2010).
Elkabetz, Y., et al. Human ES cell-derived neural rosettes reveal a functionally distinct early neural stem cell stage. Genes Dev. 22 (2), 152-165 (2008).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Citer Cet Article

Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. Flow Cytometry Protocols for Surface and Intracellular Antigen Analyses of Neural Cell Types. J. Vis. Exp. (94), e52241, doi:10.3791/52241 (2014).