Cytométrie en flux pour les protocoles surface et intracellulaire Antigen analyses des types cellulaires de neurones

Summary

We provide a detailed description of a protocol for flow cytometric analysis of surface antigens and/or intracellular antigens in neural cell types. Critical aspects of experimental planning, step-by-step methodological procedures, and fundamental principles of flow cytometry are explained in order to enable neurobiologists to exploit this powerful technology.

Abstract

Flow cytometry has been extensively used to define cell populations in immunology, hematology and oncology. Here, we provide a detailed description of protocols for flow cytometric analysis of the cluster of differentiation (CD) surface antigens and intracellular antigens in neural cell types. Our step-by-step description of the methodological procedures include: the harvesting of neural in vitro cultures, an optional carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-labeling step, followed by surface antigen staining with conjugated CD antibodies (e.g., CD24, CD54), and subsequent intracellar antigen detection via primary/secondary antibodies or fluorescently labeled Fab fragments (Zenon labeling). The video demonstrates the most critical steps. Moreover, principles of experimental planning, the inclusion of critical controls, and fundamentals of flow cytometric analysis (identification of target population and exclusion of debris; gating strategy; compensation for spectral overlap) are briefly explained in order to enable neurobiologists with limited prior knowledge or specific training in flow cytometry to assess its utility and to better exploit this powerful methodology.

Introduction

La cytométrie en flux a été largement exploitée dans l'immunologie, hématologie et en oncologie pour définir des populations de cellules via des propriétés intrinsèques de dispersion, l'expression d'antigènes de surface cellulaire, et d'autres paramètres de fluorescence ^3.1. Nos connaissances dans le sang le développement de la lignée et la maladie sont le résultat d'un degré significatif de l'amélioration continue de cette méthodologie après sa mise en œuvre initiale de ^4,5. Sensibilisation accrue du potentiel analytique quantitative et globale de cytométrie en flux a récemment encouragé son utilisation plus répandue dans la recherche sur les cellules souches et peut permettre des progrès similaire profonde dans un délai plus court ^6. Toutefois, l'application de la cytométrie en flux pour analyser spécifiquement et isoler des populations de neurones a longtemps été considérée comme difficile. Contrairement aux cellules hématopoïétiques qui existent naturellement en suspension, des types de cellules neurales sont typiquement récoltées à partir de sources excessivement complexes qui peuvent comprendre des cellules gliales et divers outres cellules environnantes ainsi que d'un réseau complexe de neurones de processus portant. Par conséquent, la neurobiologie a encore mis en œuvre la polyvalence de cytométrie de flux à son potentiel complet dans les routines quotidiennes de recherche. Toutefois, aussi longtemps que la suspension de cellules viables unique peut être générée (et protocoles ont été conçus et optimisés à cet effet ^7), la cytométrie en flux et les cellules activé par fluorescence (FACS) peut être considéré comme un élément précieux du répertoire analytique en neurobiologie ^8-11.

. Figure 1. Principe de l'analyse et de composants un cytomètre de flux cytométrie flux cytomètres de flux comprennent trois systèmes principaux: fluidiques, l'optique et l'électronique. Un écoulement laminaire de cellules en suspension (préparée à partir de tissu primaire ou en culture in vitro) est accomplie par la gaine de fluid via focalisation hydrodynamique, limitant l'échantillon à son noyau central. Les éléments optiques sont constitués de lasers qui illuminent le flux de cellules et de filtres optiques qui dirigent le signal de détecteurs appropriés. Les signaux lumineux détectés sont convertis en signaux électroniques, ensuite traitées par un ordinateur et visualisées sur un moniteur pour l'analyse des données et de déclenchement. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Les utilisateurs de flux profit des méthodes de cytométrie d'au moins une compréhension de base des fondamentaux sous-jacents, y compris les blocs de construction d'un cytomètre (pour revue voir ^12,13; voir aussi la figure 1). Un faisceau laser croise un flux fluide hydrodynamique concentré qui contient les cellules en suspension, qui à son tour passent par le faisceau laser dans "fichier unique" un après l'autre. Le interceptisur une cellule (ou tout autre particule, d'ailleurs) avec les résultats du laser dans la diffusion de la lumière à partir de ce point d'interrogation. La lumière diffusée peut être détectée dans la direction de poursuite laser (diffusion vers l'avant, associée à la taille de la particule), ainsi que perpendiculairement à sa direction (dispersion latérale; reflétant la granulosité de la particule / cellule). Ces propriétés de dispersion susmentionnés ne nécessitent pas de marquage spécifique, ce est pourquoi un échantillon non marqué (ou encore les débris cellulaires, des bulles d'air, etc.) va générer un signal (événement) sur la bivariée diffusion vers l'avant par rapport diagramme de dispersion latérale couramment utilisé pour déclenchement initial. En utilisant les lasers et des filtres spécifiques pour l'excitation et l'émission des spectres correspondant appropriées, une cellule peut être analysé pour déterminer sa positivité, le niveau d'intensité, ou l'absence de marqueurs fluorescents. La majorité des applications de cytométrie en flux ont porté sur la caractérisation par des antigènes de surface cellulaire. Contrairement à la LINEAG hématopoïétiquee, la lignée de neurones est resté moins largement définie selon les modèles ⁵ d'expression de l'épitope de surface. Un avantage de l'exploitation des antigènes de surface est que les cellules vivantes peuvent être soumis à des paradigmes de tri cellulaire telles que FACS. En revanche, l'antigène intracellulaire coloration nécessite fixation et perméabilisation étapes de médiation de l'interaction épitope-anticorps, ce qui empêche les applications en aval qui nécessitent des cellules viables. Fait à noter, ces approches permettent encore de nombreux essais quantitatifs ¹⁴ ainsi que des analyses en aval pour l'ARN et l'expression des protéines ^15. Hématologie, l'immunologie et de l'oncologie ont souvent utilisé plus d'une douzaine de marqueurs en collaboration pour définir des sous-populations particulières ^16. En outre, la cytométrie de masse CyTOF ou peuvent maintenant être utilisés pour analyser jusqu'à 30 paramètres simultanément ^17,18.

Pour des applications de cellules souches neurales, ainsi que des cultures primaires ^14,19,20 le hétérogénéité des cellules dansvitro est un phénomène commun ^21-23. Les cellules qui ne représentent pas la population cible d'intérêt incarnent un facteur potentiellement confusion pour la lecture expérimentale ^24,25. Idéalement, les différents sous-ensembles cellulaires présentes dans une suspension de cellules hétérogène portent les profils d'expression de l'antigène distinctes (connus ou encore à déchiffrer), qui peuvent être utilisés pour définir ces différentes populations. La cytométrie en flux peut donc jouer un rôle crucial dans la résolution de l'hétérogénéité cellulaire et, ainsi, faciliter les applications biomédicales (essais in vitro, thérapie cellulaire) et d'optimiser la lecture quantitative en se concentrant sur ​​le sous-ensemble le plus pertinent ^24,26. Diverses combinaisons d'antigènes de surface ont été identifiés au cours des dernières années afin de permettre la quantification et l'isolement de types spécifiques de cellules neurales. Cela comprend CD133 pour l'enrichissement de cellules souches neurales ^27, une combinaison du CD15 / CD24 / CD29 des antigènes de surface pour l'isolement de NSC, differentiaTed neurone et les cellules de la crête neurale ²⁸ ou CD15 / CD24 / CD44 / CD184 / CD271 pour isoler des sous-ensembles de neurones et cellules gliales ^25, entre autres signatures ^29,30. Au-delà de neurones comprennent des marqueurs gliaux A2B5 ^{31, 25} CD44, NG2 ³² et ³³ GLAST. Une publication récente a exploité le mésencéphale platelage précurseur marqueur CORIN ^34,35 pour enrichir précurseurs dopaminergiques dans la maladie de Parkinson transplantation de cellules paradigmes ^36. CD molécules ne sont pas seulement des marqueurs, mais fonctionnellement pertinents de médiateurs interactions cellule-cellule et de la capacité d'une cellule à répondre à des signaux à partir de molécules de la matrice extracellulaire et des facteurs de croissance ^37. Une stratégie de renforcer encore l'arsenal des antigènes CD combinatoires pour caractériser le développement de la lignée neuronale est d'utiliser des marqueurs intracellulaires connues pour cribler et définir des combinaisons d'antigènes de CD pour un type cellulaire particulier d'intérêt. Nous avons récemment exploité une telle approche et identifié CD49F ^– / CD200 des profils d'expression combinatoires ^élevées que une nouvelle approche pour enrichir des sous-ensembles de neurones différenciés neuronale pluripotentes induites systèmes de culture de cellules souches ^38. Ici, nous incluons et discutons ce dernier protocole (et des variations de ceux-ci en option), dans lequel une coloration de surface et une coloration intracellulaire peuvent être utilisés simultanément pour définir des sous-populations de cellules neurales par cytométrie de flux.

Figure 2. Schéma du options de protocole expérimental. La figure illustre une représentation schématique des principales étapes dans le protocole. Les étapes facultatives (CFSE de colorants d'étiquetage ou d'antigène intracellulaire) sont indiquées par des cadres gris clair. Après la récolte, il est indispensable pour évaluer la viabilité cellulaire et nombre de suspensions de cellules neurales avant la coloration de la surface cellulaire. Positifainsi que des contrôles négatifs doivent être inclus, en plus des échantillons d'intérêt. Les échantillons peuvent être analysés par analyse de cytométrie en flux et / ou utilisés dans les paradigmes de triage des cellules. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Bien que nous ayons précédemment utilisé anticorps primaire en combinaison avec un anticorps secondaire pour la coloration intracellulaire ^38, nous introduisons maintenant étiquetage non covalente de l'anticorps primaire par l'intermédiaire de fragments Fab fluorescents (d'étiquetage Zenon) comme une légère variation, ce qui réduit les étapes de manipulation de la cellule ^39. En outre, comme un autre exemple de la polyvalence du protocole, nous employons un étiquetage facultatif d'un sous-ensemble expérimentale par carboxyfluorescéine succinimidyl ester (CFSE) avant l'antigène de surface de coloration. Cette CFSE pré-étiquetage permet la comparaison directe immédiate de deux lignées cellulaires ou des conditions expérimentales (CFSE marqué vs. non marqué) dans un tube à échantillon unique, la réduction ou la variance des différences subtiles dans le temps d'incubation et l'enregistrement anticorps. CFSE est un colorant fluorescent mis en place qui est couramment utilisé pour le suivi de la cellule ^40, dans la prolifération ^{41,42 43,44} expériences par code barre. Enfin, alors que des mesures réelles de tri (FACS, séparation immunomagnétique ou immunopanning) ne font pas partie de ce protocole, en principe, les procédures de récolte et d'étiquetage décrites ici ne échantillons de rendement qui peuvent être soumis à la surface l'antigène ou des applications intracellulaires base étiquetage-tri ^{15 25,28.}

Avec cet article, nous visons à: résumer une surface viable protocole antigène coloration ^25,28, résumer un protocole pour la détection de cibles intracellulaires ainsi que la surface combinée et intracellulaire analyse de l'antigène ^38, présenter un CFSE étiquetage de teinture étape intracellulaire ^41,45 comme un option expérimentale pour comcomparative analyse des populations de cellules neurales, et résumer les approches à l'écoulement analyse cytométrique (des contrôles appropriés ^13,46, ouverture de porte stratégie et la présentation des données ^47).

Protocol

1. Neural cellulaire récolte Évaluation au microscope: Avant d'entreprendre une expérience, vérifier l'état de la culture avec champ lumineux ou microscopie à contraste de phase. REMARQUE: Bien que le tissu neural primaire obtenu à partir dissections est, en principe, également ouvertes à couler analyse cytométrique 14,28, se il vous plaît noter que l'accent mis par le protocole est sur ​​les cellules obtenues à partir de systèmes de cellules neurales <e…

Representative Results

Le protocole présenté ici permet d'approches expérimentales polyvalent (figure 2). Dans sa version la plus courte (étapes 1, 3 et 6), il peut être considéré comme un guide pour les simples coloration des antigènes de surface. Dans sa forme la plus complexe, un certain nombre de paradigmes co-marquage avec une gamme d'antigènes intracellulaires peut être poursuivi (étapes facultatives 2 et / ou 4-5). E…

Discussion

Le protocole présenté ici est bien établie pour les cultures de cellules neurales dérivées de cellules souches humaines, mais peut être appliqué également à d'autres sources de cellules neurales, y compris le tissu primaire ou des lignées de cellules neurales. En plus des sources embryonnaires, les cellules neuronales souches ou progénitrices peuvent être extraits à partir des régions neurogènes de cerveau adulte ^27. En outre, la cytométrie en flux et FACS peuvent être exploitées à quan…

Materials

DMEM/F12 (1:1) (Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12)	Life Technologies	11330057	www.lifetechnologies.com
DPBS without Ca2+ Mg2+	Life Technologies	14190169	www.lifetechnologies.com
Fetal bovine serum, qualified, E.U.-approved, South America origin (FBS)	Life Technologies	10270-106	www.lifetechnologies.com
MEM Non-essential amino acids (100 x)	Life Technologies	11140035	www.lifetechnologies.com
TrypLE Express	Life Technologies	12604013	www.lifetechnologies.com
Trypan blue solution, 0.4%	Life Technologies	15250061	www.lifetechnologies.com
Paraformaldehyde	Carl Roth	335.3	www.carlroth.com
Bovine serum albumin (BSA) Fraction V	PAA Laboratories, Coelbe	K41-001	www.gelifesciences.com
Tween-20 Detergent	Calbiochem	655205	www.merckmillipore.de
Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)	eBioscience	65-0850-84	www.ebioscience.com
DMSO	AppliChem	A1584	www.applichem.com
Bottle top filters express plus 0.22 µm, 250 ml	Millipore	SCGPU02RE	www.millipore.com
Cell culture treated flasks (T 25)	NUNC	156367	www.thermoscientific.com
Cell culture treated flasks (T 75)	NUNC	156499	www.thermoscientific.com
Conical tubes (15 ml)	Greiner Bio-One	188271	www.greinerbioone.com
Conical tubes (50 ml)	Greiner Bio-One	227261	www.greinerbioone.com
Pasteur pipet, glass (150 mm)	STEIN Labortechnik, Remchingen	S03710150	www.stein-labortechnik.de
Pipet tips (0.1-10 µl)	Corning	4125	www.corning.com
Pipet tips (1-200 µl)	Corning	4126	www.corning.com
Pipet tips (100-1000 µl)	Corning	4129	www.corning.com
Serological pipets, 5 ml	Corning	4051	www.corning.com
Serological pipets, 10 ml	Corning	4101	www.corning.com
Serological pipets, 25 ml	Corning	4251	www.corning.com
Microcentrifuge tubes (0.5 ml)	Sarstedt	72,699	www.sarstedt.com
Microcentrifuge tubes (1.5 ml)	Greiner Bio-One	616201	www.greinerbioone.com
Microcentrifuge tubes (2.0 ml)	Sarstedt	72,695,500	www.sarstedt.com
Anti-Human CD24 APC monoclonal antibody	eBioscience	17-0247-42	www.ebioscience.com Working dilution 1:50
Anti-Human CD54 PE monoclonal antibody	eBioscience	12-0549-42	www.ebioscience.com Working dilution 1:50
Neuronal Class III β-Tubulin (Tuj1) polyclonal antibody	Covance	PRB-435P	www.covance.com Working dilution 1:2000
Alexa Fluor 488 Donkey anti Rabbit	Life Technologies	A21206	www.lifetechnologies.com Working dilution 1:2000
Zenon® Fluorescein Rabbit IgG Labeling Kit	Life Technologies	Z-25342	www.lifetechnologies.com
Neubauer-Improved counting chamber	Marienfeld	0640010	www.marienfeld-superior.com
Vortex	Scientific Industries	G560E	www.scientificindustries.com
Thermomixer comfort	Eppendorf	5355 000.001	www.eppendorf.com
Accuri C6 flow cytometer	Becton Dickinson (BD)	653118	www.bdbiosciences.com/instruments/accuri
Microcentrifuge refrigerated, PerfectSpin 24 R	Peqlab	91-PSPIN-24R	www.peqlab.de
Orbital shaker, Unimax 1010	Heidolph	543-12310-00	www.heidolph-instruments.de
Centrifuge refrigerated, Rotanta 96 RC	Hettich	4480-50	www.hettichlab.com
Class II Biological safety cabinet Safe 2020	Thermo Scientific	51026640	www.thermoscientific.com
CO2 Incubator, Heracell 240i	Thermo Scientific	51026331	www.thermoscientific.com
Vacuum system, Vacusafe comfort	Integra Biosciences	158320	www.integra-biosciences.de
Microscope, Axiovert 40 CFL	Zeiss	451212	www.zeiss.de
Pipet controller, accu-jet pro	Brand	26303	www.brand.de
Micropipet, Pipetman neo P20N (2-20 µl)	Gilson	F144563	www.gilson.com
Micropipet, Pipetman neo P200N (20-200 µl)	Gilson	F144565	www.gilson.com
Micropipet, Pipetman neo P1000N (100-1000 µl)	Gilson	F144566	www.gilson.com