Flow Cytometry Protocols for Surface and Intracellular Antigen Analyses of Neural Cell Types

Vishal Menon; Ria Thomas; Arun R. Ghale; Christina Reinhard; Jan Pruszak

doi:10.3791/52241

JoVE Journal > Neuroscience

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Neurosciences

ניתוח cytometry זרימת פרוטוקולים למשטח והתאי Antigen של סוגי תאים עצביים

Published: December 18, 2014

doi:

10.3791/52241

Vishal Menon, Ria Thomas², Arun R. Ghale³, Christina Reinhard, Jan Pruszak⁴

¹Emmy Noether-Group for Stem Cell Biology, Department of Molecular Embryology, Institute of Anatomy and Cell Biology,University of Freiburg, ²Spemann Graduate School of Biology and Medicine and Faculty of Biology,University of Freiburg, ³School of Life Sciences,Keele University, ⁴Center for Biological Signaling Studies (BIOSS),University of Freiburg

Summary

We provide a detailed description of a protocol for flow cytometric analysis of surface antigens and/or intracellular antigens in neural cell types. Critical aspects of experimental planning, step-by-step methodological procedures, and fundamental principles of flow cytometry are explained in order to enable neurobiologists to exploit this powerful technology.

Abstract

Flow cytometry has been extensively used to define cell populations in immunology, hematology and oncology. Here, we provide a detailed description of protocols for flow cytometric analysis of the cluster of differentiation (CD) surface antigens and intracellular antigens in neural cell types. Our step-by-step description of the methodological procedures include: the harvesting of neural in vitro cultures, an optional carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-labeling step, followed by surface antigen staining with conjugated CD antibodies (e.g., CD24, CD54), and subsequent intracellar antigen detection via primary/secondary antibodies or fluorescently labeled Fab fragments (Zenon labeling). The video demonstrates the most critical steps. Moreover, principles of experimental planning, the inclusion of critical controls, and fundamentals of flow cytometric analysis (identification of target population and exclusion of debris; gating strategy; compensation for spectral overlap) are briefly explained in order to enable neurobiologists with limited prior knowledge or specific training in flow cytometry to assess its utility and to better exploit this powerful methodology.

Introduction

Cytometry זרימה נוצל בהרחבה באימונולוגיה, המטולוגיה ואונקולוגיה להגדיר אוכלוסיות תאים באמצעות מאפיינים פנימיים פיזור, ביטוי אנטיגן שטח פני תא, ופרמטרים אחרים הקרינה ^1-3. תובנות שלנו לפיתוח שושלת דם ומחלות הן תוצאה למידה משמעותית של העידון המתמשך של מתודולוגיה זו לאחר ^4,5 היישום לראשונה שלה. הגברת מודעות לפוטנציאל האנליטי כמותיים והכולל של זרימת cytometry לאחרונה עודדו את השימוש הנרחב יותר שלה במחקר בתאי גזע ועשויות לאפשר התקדמות דומה עמוקה במסגרת זמן קצרה יותר ^6. עם זאת, היישום של הזרימה cytometry לנתח באופן ספציפי ולבודד אוכלוסיות עצביות נתפס עוד מאתגר. בניגוד לתאי hematopoietic שקיימים באופן טבעי בהשעיה, סוגים עצביים תא נקצרים בדרך כלל ממקורות מוגזמים מורכבים שעשויות לכלול גליה וo השונותיס תאים המקיפים כמו גם רשת סבוכה של תאי עצב נושאות תהליך. כתוצאה מכך, נוירוביולוגיה טרם ליישם את הרבגוניות של הזרימה cytometry לפוטנציאל המלא שלה בשגרת מחקר יומית. עם זאת, כל עוד השעיה תא בודדת קיימא יכולה להיות שנוצרה (ופרוטוקולים כבר המציא ומותאם במיוחד למטרה זו ^7), cytometry זרימה ותא הקרינה המופעל מיון (FACS) יכול להיחשב מרכיב חשוב ברפרטואר האנליטיות בנוירוביולוגיה ^8-11.

. Cytometers עיקרון איור 1. ניתוח cytometric זרימה ורכיבים של cytometer זרימת זרימה יורכב משלוש מערכות עיקריות: fluidics, אופטיקה ואלקטרוניקה. זרימה יעילה של תאים בתרחיף (שהוכנה מרקמות ראשוניות או בתרבות חוץ גופית) מושגת על ידי flui הנדןד באמצעות הידרודינמית התמקדות, המגביל את המדגם למרכז הליבה שלה. החלקים האופטיים מורכבים מלייזרים שמאירים את הזרם של תאים ומסננים אופטיים המכוונים את האות לגלאים המתאימים. אותות האור זוהו מומרים לאותות אלקטרוניים, מעובד לאחר מכן על ידי מחשב ודמיינו על צג לניתוח נתונים וgating. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

משתמשים של רווח שיטות cytometric זרימה מלפחות הבנה בסיסית של היסודות הבסיסיים כוללים אבני הבניין של cytometer (לסקירה ראה ^12,13; גם ראו איור 1). קרן לייזר מצטלבת עם זרם fluidic hydrodynamically ממוקד המכיל את התאים בתרחיף, אשר בתורו לעבור בקרן הלייזר ב'קובץ יחיד "בזה אחר זה. Interceptiבתא (או כל חלקיק אחר, לצורך העניין) עם תוצאות הלייזר בפיזור של אור מחקירת נקודה זו. אור מפוזר ניתן לאתרם בהמשך לכיוון הלייזר (הפיזור קדימה, הקשורים לגודל של החלקיקים), כמו גם בניצב לכיוון שלו (פיזור הצד; המשקף את granulosity של החלקיקים / התא). מאפייני הפיזור האמורים אלה אינם דורשים תיוג ספציפי, ולכן מדגם ללא תווית (או גם פסולת תאית, בועות אוויר, וכו ') יפיק אות (אירוע) על הפיזור קדימה bivariate לעומת פיזור עלילה בצד משמשת בדרך כלל לgating הראשוני. על ידי שימוש בלייזרים ומסננים ספציפיים לספקטרום עירור והפליטה המתאים המתאימים, תאים ניתן לנתח לחיוביות שלה, רמת האינטנסיביות, או היעדרם של סמני ניאון. רוב יישומי cytometric זרימה התמקדו באפיון באמצעות אנטיגנים פני תא. בניגוד לlineag hematopoieticדואר, השושלת העצבית נשארה מוגדרת פחות בהרחבה על פי דפוסי ביטוי epitope משטח ^5. אחד יתרונות של ניצול אנטיגנים פני השטח הוא שיכולים להיות נתונה תאי חיים ועד לתא פרדיגמות מיון כגון FACS. בניגוד לכך, מכתים אנטיגן תאיים דורש צעדי קיבעון וpermeabilization לתווך את האינטראקציה epitope-נוגדן, המונע יישומים במורד הזרם שדורשים תאי קיימא. ראוי לציין, גישות כאלה עדיין לאפשר למבחנים כמותיים רבים ¹⁴ וכן ניתוחים במורד הזרם לRNA וחלבון ביטוי ^15. המטולוגיה, אימונולוגיה ואונקולוגיה השתמשו לעתים קרובות יותר מתריסר סמנים בשיתוף להגדיר תת-אוכלוסיות מסוימות ^16. בנוסף, cytometry ההמוני או CyTOF כעת ניתן להשתמש כדי לנתח עד 30 פרמטרים בו זמנית ^17,18.

עבור יישומי תאי גזע עצביים, כמו גם תרבויות עיקריות ^14,19,20 ההטרוגניות של תאים במבחנה היא תופעה נפוצה ^21-23. התאים לא מייצגים את אוכלוסיית היעד של עניין מגלמים גורם שעלול להיות מבלבל עבור קריאה ניסיונית ^24,25. נוח, תת הסלולרי השונים קיימים בתוך השעיה תא הטרוגנית לשאת פרופילי ביטוי אנטיגן שונים (ידועים או שעדיין לא פוענחו), אשר יכול להיות מנוצל כדי להגדיר אלה אוכלוסיות שונות. Cytometry זרימה ומכאן יכול לשחק תפקיד מכריע בפתרון ההטרוגניות סלולרית, ובכך, להקל על יישומים ביו-רפואיים (במבחנה מבחני, טיפול בתאים) ולייעל את הקריאה כמותית על ידי התמקדות בתת-קבוצה הרלוונטית ביותר ^24,26. שילובי אנטיגן פני השטח שונים זוהו בשנים האחרונות, כדי לאפשר quantitation ובידוד של סוגי תאים עצביים ספציפיים. זה כולל CD133 להעשרה של תאי גזע עצביים ^27, שילוב של CD15 / CD24 / אנטיגנים משטח CD29 לבידודה של המועצה לביטחון לאומי, דיפרנציאלינוירון טד ותאי רכס עצביים ²⁸ או CD15 / CD24 / CD44 / CD184 / CD271 לבודד עצבי ותת גליה ^25, בין חתימות אחרות ^29,30. מעבר לתאי עצב, סמני גליה כוללים A2B5 ^31, CD44 ^25, NG2 ³² וGLAST ^33. הפרסום האחרון ניצל את סמן המוח התיכון floorplate מבשר קורין ^34,35 להעשיר למבשרי דופאמין בהשתלת תאי פרקינסון הפרדיגמות ^36. מולקולות CD הן לא רק סמנים, אך מתווכים רלוונטיים מבחינה תפקודית של תאי תאי אינטראקציות ושל היכולת של תא להגיב לאותות ממולקולות חוץ-תאיות וצמיחת הגורמים ^37. אסטרטגיה אחת של עוד שיפור הארסנל של אנטיגנים CD קומבינטורית לאפיין פיתוח שושלת עצבי היא להשתמש סמנים תאיים ידועים למסך וללהגדיר שילובי אנטיגן CD לסוג תא מסוים של עניין. יש לנו לאחרונה ניצלנו גישה כזו וזיהה CD49F ^– / CD200 דפוסי ביטוי קומבינטורית ^גבוהים כגישה חדשנית להעשרת תת נוירונים ממובחנים עצבי מערכות תרבות תאי גזע pluripotent המושרה ^38. כאן, אנו כוללים ולדון בפרוטוקול האחרון (ווריאציות אופציונליות ממנו) שבמכתים פני השטח וצביעה תאית ניתן להשתמש בו זמנית להגדרה תת-אוכלוסיות של תאים עצביים על ידי cytometry זרימה.

איור 2. תרשים זרימה של אפשרויות פרוטוקול ניסוי. הדמות מתארת ייצוג סכמטי של המעורבים בפרוטוקול את השלבים העיקריים. צעדים אופציונליים (צבע CFSE או תיוג אנטיגן תאיים) מסומנים על ידי קופסות צבע אפור בהירות. לאחר קציר, זה חיוני כדי להעריך את מספר הכדאיות ותא של השעיות תא עצביות לפני מכתים שטח פני תא. חיובי כגם בקרות שליליות צריכה להיות כלולות בתוספת לדגימות של עניין. ניתן לנתח דגימות על ידי ניתוח התזרים cytometric ו / או שימוש בפרדיגמות מיון תא. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

אמנם יש לנו בעבר השתמשתי נוגדן ראשוני בשילוב עם נוגדנים משני עבור מכתים תאיים ^38, אנחנו עכשיו להציג את התיוג שאינו קוולנטיים של הנוגדן הראשוני באמצעות שברי ניאון Fab (תיוג זנון) כוריאציה קלה, ובכך להפחית את הצעדים של תא מניפולציה ^39. יתר על כן, כדוגמא נוספת לרבגוניות של הפרוטוקול, אנו מעסיקים תיוג אופציונאלי של תת-קבוצה אחת ניסיונית על ידי carboxyfluorescein succinimidyl אסתר (CFSE) לפני המשטח מכתים אנטיגן. לפני תיוג CFSE כזו מאפשר השוואה המיידית הישירה של שתי שורות תאים או תנאי ניסוי (CFSE שכותרתו vs. ללא תווית) בתוך צינור מדגם יחיד, הפחתת שונות או הבדלים דקים בזמן דגירה ושמירת נוגדן. CFSE הוא צבע פלואורסצנטי הוקם המשמש בדרך כלל לתא מעקב ^40, בניסויי התפשטות ^41,42 וbarcoding ^43,44. לבסוף, בזמן שצעדים ממשיים מיון (FACS, הפרדת תאי immunomagnetic או immunopanning) אינם חלק מפרוטוקול זה, באופן עקרוני, נהלי הקצירה ותיוג המתוארים כאן לעשות דגימות תשואה שיכול להיות נתון למשטח יישומים מבוסס תיוג תאיים מיון antigen- או ^{15 25,28.}

עם מאמר זה, אנו שואפים: לסכם פרוטוקול מכתים אנטיגן שטח קיימא ^25,28, לסכם פרוטוקול לזיהוי של מטרות תאיות, כמו גם משטח משולב וניתוח אנטיגן תאיים ^38, מציג צעד תיוג צבע תאיים CFSE ^41,45 כ אפשרות ניסיונית לcomparative הניתוחים של אוכלוסיות תאים עצביות, ולסכם גישות לזרום ניתוח cytometric (שליטה ובקרה נאותה ^13,46, gating אסטרטגיה ונתונים מצגת ^47).

Protocol

1. קציר Cell העצבי הערכה על ידי מיקרוסקופ: לפני שיתחיל בניסוי, לבדוק את מצב התרבות בשדה בהיר או מיקרוסקופ לעומת שלב. הערה: בעוד רקמה עצבית העיקרית המתקבלת מניתוחים היא, …

Representative Results

הפרוטוקול שהוצג כאן מאפשר לגישות מגוונות ניסוי (איור 2). בגרסה הקצרה שלו (שלבים 1, 3 ו -6), זה יכולים להיחשב מדריך לצביעה פשוטה של אנטיגנים על פני שטח. בצורה המורכבת יותר שלו, מספר פרדיגמות שיתוף תיוג עם מגוון של אנטיגנים תאיים יכול להיות רדוף <str…

Discussion

הפרוטוקול המובא כאן הוא מבוסס היטב לתרביות תאים עצביות שמקורם בתאי גזע אנושיים, אבל יכול להיות מיושם באופן שווה למקורות תא עצביים אחרים, כולל רקמה ראשונית או שורות תאים עצביות. בנוסף למקורות עובריים, ניתן לחלץ תאי גזע עצביים או מהאזורים העצביים של המוח בוגר ^27. י…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Our research program is funded through the Emmy Noether-Program of the German Research Foundation (DFG), grant PR1132/3-1. Further support by the Müller-Fahnenberg Foundation of the University of Freiburg is gratefully acknowledged. This study was supported in part by the Excellence Initiative of the German Research Foundation (GSC-4, Spemann Graduate School).

Materials

DMEM/F12 (1:1) (Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12)	Life Technologies	11330057	www.lifetechnologies.com
DPBS without Ca²⁺ Mg²⁺	Life Technologies	14190169	www.lifetechnologies.com
Fetal bovine serum, qualified, E.U.-approved, South America origin (FBS)	Life Technologies	10270-106	www.lifetechnologies.com
MEM Non-essential amino acids (100 x)	Life Technologies	11140035	www.lifetechnologies.com
TrypLE Express	Life Technologies	12604013	www.lifetechnologies.com
Trypan blue solution, 0.4%	Life Technologies	15250061	www.lifetechnologies.com
Paraformaldehyde	Carl Roth	335.3	www.carlroth.com
Bovine serum albumin (BSA) Fraction V	PAA Laboratories, Coelbe	K41-001	www.gelifesciences.com
Tween-20 Detergent	Calbiochem	655205	www.merckmillipore.de
Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)	eBioscience	65-0850-84	www.ebioscience.com
DMSO	AppliChem	A1584	www.applichem.com
Bottle top filters express plus 0.22 µm, 250 ml	Millipore	SCGPU02RE	www.millipore.com
Cell culture treated flasks (T 25)	NUNC	156367	www.thermoscientific.com
Cell culture treated flasks (T 75)	NUNC	156499	www.thermoscientific.com
Conical tubes (15 ml)	Greiner Bio-One	188271	www.greinerbioone.com
Conical tubes (50 ml)	Greiner Bio-One	227261	www.greinerbioone.com
Pasteur pipet, glass (150 mm)	STEIN Labortechnik, Remchingen	S03710150	www.stein-labortechnik.de
Pipet tips (0.1-10 µl)	Corning	4125	www.corning.com
Pipet tips (1-200 µl)	Corning	4126	www.corning.com
Pipet tips (100-1000 µl)	Corning	4129	www.corning.com
Serological pipets, 5 ml	Corning	4051	www.corning.com
Serological pipets, 10 ml	Corning	4101	www.corning.com
Serological pipets, 25 ml	Corning	4251	www.corning.com
Microcentrifuge tubes (0.5 ml)	Sarstedt	72,699	www.sarstedt.com
Microcentrifuge tubes (1.5 ml)	Greiner Bio-One	616201	www.greinerbioone.com
Microcentrifuge tubes (2.0 ml)	Sarstedt	72,695,500	www.sarstedt.com
Anti-Human CD24 APC monoclonal antibody	eBioscience	17-0247-42	www.ebioscience.com Working dilution 1:50
Anti-Human CD54 PE monoclonal antibody	eBioscience	12-0549-42	www.ebioscience.com Working dilution 1:50
Neuronal Class III β-Tubulin (Tuj1) polyclonal antibody	Covance	PRB-435P	www.covance.com Working dilution 1:2000
Alexa Fluor 488 Donkey anti Rabbit	Life Technologies	A21206	www.lifetechnologies.com Working dilution 1:2000
Zenon® Fluorescein Rabbit IgG Labeling Kit	Life Technologies	Z-25342	www.lifetechnologies.com

Neubauer-Improved counting chamber	Marienfeld	0640010	www.marienfeld-superior.com
Vortex	Scientific Industries	G560E	www.scientificindustries.com
Thermomixer comfort	Eppendorf	5355 000.001	www.eppendorf.com
Accuri C6 flow cytometer	Becton Dickinson (BD)	653118	www.bdbiosciences.com/instruments/accuri
Microcentrifuge refrigerated, PerfectSpin 24 R	Peqlab	91-PSPIN-24R	www.peqlab.de
Orbital shaker, Unimax 1010	Heidolph	543-12310-00	www.heidolph-instruments.de
Centrifuge refrigerated, Rotanta 96 RC	Hettich	4480-50	www.hettichlab.com
Class II Biological safety cabinet Safe 2020	Thermo Scientific	51026640	www.thermoscientific.com
CO₂ Incubator, Heracell 240i	Thermo Scientific	51026331	www.thermoscientific.com
Vacuum system, Vacusafe comfort	Integra Biosciences	158320	www.integra-biosciences.de
Microscope, Axiovert 40 CFL	Zeiss	451212	www.zeiss.de
Pipet controller, accu-jet pro	Brand	26303	www.brand.de
Micropipet, Pipetman neo P20N (2-20 µl)	Gilson	F144563	www.gilson.com
Micropipet, Pipetman neo P200N (20-200 µl)	Gilson	F144565	www.gilson.com
Micropipet, Pipetman neo P1000N (100-1000 µl)	Gilson	F144566	www.gilson.com

References

Herzenberg, L. A., et al. The History and Future of the Fluorescence Activated Cell Sorter and Flow Cytometry: A View from. 48 (10), 1819-1827 (2002).
Chattopadhyay, P. K., Roederer, M. Cytometry: today’s technology and tomorrow’s horizons. Methods (San Diego, Calif). 57 (3), 251-258 (2012).
Jaye, D. L., Bray, R. A., Gebel, H. M., Harris, W. A. C., Waller, E. K. Translational applications of flow cytometry in clinical practice). J. Immunol. 188 (10), 4715-4719 (2012).
Henel, G., Schmitz, J. Basic Theory and Clinical Applications of Flow Cytometry. Lab Med. 38 (7), 428-436 (2007).
Seita, J., Weissman, I. L. Hematopoietic stem cell: self-renewal versus differentiation. Wiley Interdiscip. Rev. Syst. Biol. Med. 2 (6), 640-653 (2010).
Ulrich, H., Bocsi, J. Phenotypes of stem cells from diverse origin. Cytometry. A. 77 (1), 6-10 (2010).
Panchision, D. M., et al. Optimized flow cytometric analysis of central nervous system tissue reveals novel functional relationships among cells expressing CD133, CD15, and CD24. Stem cells. 25 (6), 1560-1570 (2007).
Meyer, R. A., Zaruba, M. E., McKhann, G. M. Flow cytometry of isolated cells from the brain. Anal. Quant. Cytol. 2 (1), 66-74 (1980).
Junger, H., Junger, W. G. CNTF and GDNF, but not NT-4, support corticospinal motor neuron growth via direct mechanisms. Neuroreport. 9 (16), 3749-3754 (1998).
McLaren, F. H., Svendsen, C. N., Vander Meide, P., Joly, E. Analysis of neural stem cells by flow cytometry: cellular differentiation modifies patterns of MHC expression. J. Neuroimmunol. 112 (1-2), 35-46 (2001).
Wang, S., Roy, N. S., Benraiss, A., Goldman, S. A. Promoter-based isolation and fluorescence-activated sorting of mitotic neuronal progenitor cells from the adult mammalian ependymal/subependymal. 22 (1-2), 167-176 (2000).
Tanke, H. J., vander Keur, M. Selection of defined cell types by flow-cytometric cell sorting. Trends Biotechnol. 11 (2), 55-62 (1993).
Baumgarth, N., Roederer, M. A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping. J. Immunol. Methods. 243 (1-2), 77-97 (2000).
Sergent-Tanguy, S., Chagneau, C., Neveu, I., Naveilhan, P. Fluorescent activated cell sorting (FACS): a rapid and reliable method to estimate the number of neurons in a mixed population. J. Neurosci. Methods. 129 (1), 73-79 (2003).
Ernst, A., et al. Neurogenesis in the striatum of the adult human brain. Cell. 156 (5), 1072-1083 (2014).
Perfetto, S. P., Chattopadhyay, P. K., Roederer, M. Seventeen-colour flow cytometry: unravelling the immune system. Nat. Rev. Immunol. 4 (8), 648-655 (2004).
Bandura, D. R., et al. Mass cytometry: technique for real time single cell multitarget immunoassay based on inductively coupled plasma time-of-flight mass spectrometry. Anal. Chem. 81 (16), 6813-6822 (2009).
Bendall, S. C., et al. Single-cell mass cytometry of differential immune and drug responses across a human hematopoietic continuum. Science. 332 (6030), 687-696 (2011).
Neveu, I., Rémy, S., Naveilhan, P. The neuropeptide Y receptors, Y1 and Y2, are transiently and differentially expressed in the developing cerebellum. Neurosciences. 113 (4), 767-777 (2002).
Pruszak, J., Just, L., Isacson, O., Nikkhah, G. Isolation and culture of ventral mesencephalic precursor cells and dopaminergic neurons from rodent brains. Curr. Protoc. Stem Cell Biol. 2 (Unit 2D.5), (2009).
Suslov, O. N., Kukekov, V. G., Ignatova, T. N., Steindler, D. A. Neural stem cell heterogeneity demonstrated by molecular phenotyping of clonal neurospheres. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (22), 14506-14511 (2002).
Bez, A., et al. Neurosphere and neurosphere-forming cells: morphological and ultrastructural characterization. Brain Res. 993 (1-2), 18-29 (2003).
Pruszak, J., Isacson, O. Molecular and cellular determinants for generating ES-cell derived dopamine neurons for cell therapy. Adv. Exp. Med. Biol. 651, 112-123 (2009).
Carson, C. T., Aigner, S., Gage, F. H. Stem cells: the good, bad and barely in control. Nat. Med. 12 (11), 1237-1238 (2006).
Yuan, S. H., et al. Cell-surface marker signatures for the isolation of neural stem cells, glia and neurons derived from human pluripotent stem cells. PloS One. 6 (3), e17540 (2011).
Roy, N. S., Cleren, C., Singh, S. K., Yang, L., Beal, M. F., Goldman, S. Functional engraftment of human ES cell-derived dopaminergic neurons enriched by coculture with telomerase-immortalized midbrain astrocytes. Nat. Med. 12 (11), 1259-1268 (2006).
Uchida, N., et al. Direct isolation of human central nervous system stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97 (26), 14720-14725 (2000).
Pruszak, J., Ludwig, W., Blak, A., Alavian, K., Isacson, O. CD15, CD24, and CD29 define a surface biomarker code for neural lineage differentiation of stem cells. Stem Cells. 27 (12), 2928-2940 (2009).
Peh, G. S. -. L., Lang, R. J., Pera, M. F., Hawes, S. M. CD133 expression by neural progenitors derived from human embryonic stem cells and its use for their prospective isolation. Stem Cells Dev. 18 (2), 269-282 (2009).
Golebiewska, A., Atkinson, S. P., Lako, M., Armstrong, L. Epigenetic landscaping during hESC differentiation to neural cells. Stem Cells. 27 (6), 1298-1308 (2009).
Dietrich, J., Noble, M., Mayer-Proschel, M. Characterization of A2B5+ glial precursor cells from cryopreserved human fetal brain progenitor cells. Glia. 40 (1), 65-77 (2002).
Nishiyama, A. NG2 cells in the brain: a novel glial cell population. Hum. Cell. 14 (1), 77-82 (2001).
Jungblut, M., et al. Isolation and characterization of living primary astroglial cells using the new GLAST-specific monoclonal antibody ACSA-1. Glia. 60 (6), 894-907 (2012).
Ono, Y., et al. Differences in neurogenic potential in floor plate cells along an anteroposterior location: midbrain dopaminergic neurons originate from mesencephalic floor plate cells. Development. 134 (17), 3213-3225 (2007).
Chung, S., et al. ES cell-derived renewable and functional midbrain dopaminergic progenitors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (23), 9703-9708 (2011).
Doi, D., et al. Isolation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Dopaminergic Progenitors by Cell Sorting for Successful Transplantation. Stem Cell Reports. 2 (3), 337-350 (2014).
Solozobova, V., Wyvekens, N., Pruszak, J. Lessons from the embryonic neural stem cell niche for neural lineage differentiation of pluripotent stem cells. Stem Cell Rev. 8 (3), (2012).
Turaç, G., et al. Combined flow cytometric analysis of surface and intracellular antigens reveals surface molecule markers of human neuropoiesis. PloS One. 8 (6), e68519 (2013).
Buchwalow, I. B., Böcker, W. Chapter 2. Immunohistochemistry: Basics and Methods. , 9-17 (2010).
Tario, J. D., et al. Optimized staining and proliferation modeling methods for cell division monitoring using cell tracking dyes. J. Vis. Exp. (70), e4287 (2012).
Lyons, A. B., Parish, C. R. Determination of lymphocyte division by flow cytometry. J. Immunol. Methods. 171 (1), 131-137 (1994).
Hawkins, E. D., et al. Measuring lymphocyte proliferation, survival and differentiation using CFSE time-series data. Nat. Protoc. 2 (9), 2057-2067 (2007).
Quah, B. J. C., Parish, C. R. The use of carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) to monitor lymphocyte proliferation. J. Vis. Exp. 44, (2010).
Sukhdeo, K., et al. Multiplex flow cytometry barcoding and antibody arrays identify surface antigen profiles of primary and metastatic colon cancer cell lines. PloS One. 8 (1), e53015 (2013).
Jiang, L., et al. Daucosterol promotes the proliferation of neural stem cells. The J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 140, 90-99 (2014).
Hulspas, R., et al. Considerations for the control of background fluorescence in clinical flow cytometry. Cytometry. B. 76 (6), 355-364 (2009).
Moloney, M., Shreffler, W. G. Basic science for the practicing physician: flow cytometry and cell sorting. Annals of Allergy, Asthm., & Immunology: Official Publication of the American College of Allergy, Asthma., & Immunology. 101 (5), 544-549 (2008).
Siebzehnrubl, F. A., et al. Isolation and characterization of adult neural stem cells. Methods Mol. Biol. 750, 61-77 (2011).
Guez-Barber, D., et al. FACS purification of immunolabeled cell types from adult rat brain). J. Neurosci. Methods. 203 (1), 10-18 (2012).
Tham, C. -. S., Lin, F. -. F., Rao, T. S., Yu, N., Webb, M. Microglial activation state and lysophospholipid acid receptor expression. Int. J. Dev. Neurosci. 21 (8), 431-443 (2003).
Nguyen, H. X., Beck, K. D., Anderson, A. J. Quantitative assessment of immune cells in the injured spinal cord tissue by flow cytometry: a novel use for a cell purification method. J. Vis. Exp. (50), e2698 (2011).
Marchenko, S., Flanagan, L. Counting human neural stem cells. J. Vis. Exp. (7), 262 (2007).
Brunlid, G., Pruszak, J., Holmes, B., Isacson, O., Sonntag, K. C. Immature and neurally differentiated mouse embryonic stem cells do not express a functional Fas/Fas ligand system. Stem Cells. 25 (10), 2551-2558 (2007).
Brewer, G. J. Isolation and culture of adult rat hippocampal neurons. J. Neurosci. Methods. 71 (2), 143-155 (1997).
Cardona, A. E., Huang, D., Sasse, M. E., Ransohoff, R. M. Isolation of murine microglial cells for RNA analysis or flow cytometry. Nat. Protoc. 1 (4), 1947-1951 (2006).
Nielsen, J. A., Maric, D., Lau, P., Barker, J. L., Hudson, L. D. Identification of a novel oligodendrocyte cell adhesion protein using gene expression profiling. J. Neurosci. 26 (39), 9881-9891 (2006).
Daneman, R., et al. The mouse blood-brain barrier transcriptome: a new resource for understanding the development and function of brain endothelial cells. PloS One. 5 (10), e13741 (2010).
Gräbner, R., Till, U., Heller, R. Flow cytometric determination of E-selectin, vascular cell adhesion molecule-1, and intercellular cell adhesion molecule-1 in formaldehyde-fixed endothelial cell monolayers. Cytometry. 40 (3), 238-244 (2000).
Quah, B. J. C., Parish, C. R. New and improved methods for measuring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo using CFSE-like fluorescent dyes. J. Immunol. Methods. 379 (1-2), 1-14 (2012).
Lathia, J. D., et al. High-throughput flow cytometry screening reveals a role for junctional adhesion molecule a as a cancer stem cell maintenance factor. Cell Rep. 6 (1), 117-129 (2014).
Ganat, Y. M., et al. Identification of embryonic stem cell-derived midbrain dopaminergic neurons for engraftment. J. Clin. Invest. 122 (8), 2928-2939 (2012).
Hedlund, E., et al. Embryonic stem cell-derived Pitx3-enhanced green fluorescent protein midbrain dopamine neurons survive enrichment by fluorescence-activated cell sorting and function in an animal model of Parkinson’s disease. Stem Cells. 26 (6), 1526-1536 (2008).
Maroof, A. M., et al. Directed differentiation and functional maturation of cortical interneurons from human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 12 (5), 559-572 (2013).
Chivet, M., Hemming, F., Pernet-Gallay, K., Fraboulet, S., Sadoul, R. Emerging role of neuronal exosomes in the central nervous system. Front. Physiol. 3, 145 (2012).
Graner, M. W., et al. Proteomic and immunologic analyses of brain tumor exosomes. FASEB J. 23 (5), 1541-1557 (2009).
Eldh, M., Lötvall, J. Isolation and characterization of RNA-containing exosomes. J. Vis. Exp. (59), e3037 (2012).
Capela, A., Temple, S. LeX is expressed by principle progenitor cells in the embryonic nervous system, is secreted into their environment and binds Wnt-1. Dev. Biol. 291 (2), 300-313 (2006).
Nieoullon, V., Belvindrah, R., Rougon, G., Chazal, G. mCD24 regulates proliferation of neuronal committed precursors in the subventricular zone. Mol. Cell. Neurosci. 28 (3), 462-474 (2005).
Nagato, M., et al. Prospective characterization of neural stem cells by flow cytometry analysis using a combination of surface markers. J. Neurosci. Res. 80 (4), 456-466 (2005).
Hall, P. E., Lathia, J. D., Miller, N. G. A., Caldwell, M. A., French-Constant, C. Integrins are markers of human neural stem cells. Stem Cells. 24 (9), 2078-2084 (2006).
Hargus, G., et al. Differentiated Parkinson patient-derived induced pluripotent stem cells grow in the adult rodent brain and reduce motor asymmetry in Parkinsonian rats. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (36), 15921-15926 (2010).
Elkabetz, Y., et al. Human ES cell-derived neural rosettes reveal a functionally distinct early neural stem cell stage. Genes Dev. 22 (2), 152-165 (2008).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Citer Cet Article

Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. Flow Cytometry Protocols for Surface and Intracellular Antigen Analyses of Neural Cell Types. J. Vis. Exp. (94), e52241, doi:10.3791/52241 (2014).