Exécution sous-rétinienne injections chez les rongeurs de produire des cellules de l'épithélium pigmentaire rétinien Suspension

Résumé

Nous présentons ici un protocole accepté par la communauté en format multimédia pour l’injection sous-rétinienne d’un bolus de cellules EPR chez le rat et la souris. Cette approche peut être utilisée pour déterminer les potentiels de sauvetage, les profils d’innocuité et les capacités de survie des cellules EPR greffées lors de l’implantation dans des modèles animaux de dégénérescence rétinienne.

Résumé

La conversion de la lumière en impulsions électriques se produit dans la rétine externe et est réalisée en grande partie par bâtonnets et des cônes photorécepteurs et l'épithélium pigmentaire rétinien (EPR) des cellules. RPE fournir un soutien essentiel pour les photorécepteurs et la mort ou le dysfonctionnement des cellules RPE est caractéristique liée à l'âge dégénérescence maculaire (DMLA), la principale cause de perte de vision permanente chez les personnes de 55 ans et plus. Alors pas de remède pour AMD a été identifié, l'implantation d'un EPR sain dans les yeux malades peut se avérer un traitement efficace, et un grand nombre de cellules RPE peut être facilement généré à partir de cellules souches pluripotentes. Plusieurs questions intéressantes quant à l'innocuité et l'efficacité de la prestation des cellules RPE peuvent encore être examinés dans des modèles animaux, et des protocoles bien acceptées utilisées pour injecter RPE ont été développés. La technique décrite ici a été utilisé par plusieurs groupes dans diverses études et consiste à créer d'abord un trou dans l'œil avec une aiguille. Ensuite, une seringue avec une bluaiguille nt chargé avec des cellules est inséré à travers le trou et passe à travers le corps vitré jusqu'à ce qu'il touche le RPE. En utilisant cette méthode d'injection, ce qui est relativement simple et nécessite un minimum d'équipement, nous obtenons une intégration cohérente et efficace des cellules RPE dérivés de cellules souches dans le RPE entre hôte qui empêche la quantité importante de dégénérescence des photorécepteurs chez des modèles animaux. Bien que ne faisant pas partie du protocole proprement dit, on décrit également comment déterminer l'ampleur du traumatisme induit par l'injection, et la façon de vérifier que les cellules ont été injectées dans l'espace sous-rétinien en utilisant des modalités d'imagerie in vivo. Enfin, l'utilisation de ce protocole ne est pas limitée aux cellules RPE; il peut être utilisé pour injecter ne importe quel composé ou d'une cellule dans l'espace sous-rétinien.

Introduction

La rétine sensorielle est organisée en niveaux fonctionnels de neurones, de cellules gliales et de cellules endothéliales. Les photorécepteurs à l’arrière de la rétine sont activés par la lumière ; Grâce à la phototransduction, ils convertissent les photons en signaux électriques qui sont affinés par les interneurones et transmis au cortex visuel du cerveau. La phototransduction ne peut se produire sans les efforts coordonnés des cellules gliales de Mueller et de l’épithélium pigmentaire rétinien (EPR). Les EPR sont organisés en une monocouche directement derrière les photorécepteurs et remplissent des fonctions multiples et diverses faisant partie intégrante de la fo....

Protocole

REMARQUE: Tous les animaux ont été traités conformément aux directives éthiques établies par l'Institut de recherche Scripps.

1. Préparation des matériaux pour l'injection (~ 20 min)

1. Solution de dissociation cellulaire pré-chaud (de préférence une qui est inactivé par dilution avec du sérum non), du PBS stérile et le milieu de culture (Tableau 1).
2. Stériliser la seringue avec une aiguille émoussée de démonter les pièces d'ébullition et dans l'eau pendant 15 min.

2. Préparation des cellules RPE pour injection (~ 30 min à 1 h)

Résultats

Nous pouvons livrer une suspension de cellules RPE dans l'espace sous-rétinien de rongeurs rapidement et régulièrement en utilisant la technique décrite dans ce manuscrit. Bien que pas nécessaire, les traumatismes peuvent être considérablement réduits au minimum en utilisant la configuration illustrée avec un micromanipulateur à la figure 1A & B. Maintenir le rongeur comme représenté sur la figure 1C pour une exophtalmie temporaire. Les étapes sont les mêmes se il est effectué a.......

Discussion

Dans cet article, nous décrivons une méthode relativement simple pour réaliser des injections sous-rétiniens de cellules RPE en suspension dans les rats et les souris. Le protocole est facile à apprendre et plus d'expérience avec la technique se traduiront par moins de traumatismes (figure 3, ce qui représente l'un des meilleurs injections), surtout si un micromanipulateur est utilisé (figure 1A). Tout traumatisme peut être contrôlée in vivo avec un système d'ALSC e.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
2-Mercaptoéthanol (55 mM)	Gibco  ;	21985-023	50 ml x 1  ;
Scapers cellulaires	VWR	89260-222	Boîtier x 1
CellTracker Green CMFDA	Sondes moléculaires	C34552	50 µ ; g x 20
DPBS, sans calcium, sans magnésium	Gibco	14190-144	500 ml x 1  ;
Fast Green	Sigma-Aldrich	F7258	25 g x 1  ;
Genteal Geldrops Gouttes oculaires lubrifiantes modérées à sévères  ;	Walmart	4060941	25 ml x 1
Hamilton Modèle 62 RN SYR	Hamilton	87942	Seringue x 1  ;
Hamilton Aiguille 33 G, 0.5", pointe 3 (acier inoxydable 304)	Hamilton	7803-05	Aiguilles x 6
Knockout DMEM	Gibco	10829-018	500 ml x 1  ;
Sérum KnockOut de Remplacement	Gibco	10828-028	500 ml x 1  ;
L-Glutamine 200 mM	Gibco	25030-081	100 ml x 1
Support magnétique	Leica Biosystems	39430216	Stand x 1
MEM Solution d’acides aminés non essentiels 100X  ;	Gibco	11140-050	100 ml x 1
Micromanipulateur	Leica Biosystems	3943001	Manipulateur x 1
Pénicilline-Streptomycine (10 000 U/ml)	Gibco	15140-122	100 ml x 1
Seringues à embout coulissant sans aiguilles BD  ; (3 ml)  ;   ;	VWR	BD309656	pack x 1
aiguilles à usage spécialisé BD  ; (30 G, 1")	VWR	BD305128	Box x 1
TrypLE Express Enzyme (1X), sans rouge de phénol	Gibco	12604013	100 ml x 1