Génération de cellules T humaines allo-spécifiques du sang périphérique

Summary

Cet article décrit une méthode de génération et de propagation de clones de lymphocytes T humains qui répondent spécifiquement à un alloantigène défini. Ce protocole peut être adapté pour le clonage de lymphocytes T humains spécifiques à une variété de ligands peptide-CMH.

Abstract

L’étude de la biologie des lymphocytes T humains implique souvent l’examen des réponses aux ligands activateurs. Les lymphocytes T reconnaissent et répondent aux antigènes peptidiques traités présentés par les molécules du CMH (orthologue humain HLA) par le biais du récepteur des lymphocytes T (TCR) d’une manière très sensible et spécifique. Alors que la fonction principale des lymphocytes T est de médier les réponses immunitaires protectrices aux antigènes étrangers présentés par l’auto-CMH, les lymphocytes T répondent de manière robuste aux différences antigéniques dans les tissus allogéniques. Les réponses des lymphocytes T aux alloantigènes peuvent être décrites comme une alloréactivité directe ou indirecte. Dans l’alloréactivité, le lymphocyte T répond par une reconnaissance très spécifique à la fois du peptide présenté et de la molécule du CMH. La réponse oligoclonale robuste des lymphocytes T à la stimulation allogénique reflète le grand nombre d’alloantigènes potentiellement stimulants présents dans les tissus allogéniques. Bien que l’étendue des réponses des lymphocytes T alloréactifs soit un facteur important dans l’initiation et la médiation de la pathologie associée aux réponses alloréactives biologiquement pertinentes telles que la maladie du greffon contre l’hôte et le rejet de l’allogreffe, elle peut empêcher l’analyse des réponses des lymphocytes T aux ligands allogéniques. À cette fin, ce protocole décrit une méthode permettant de générer des lymphocytes T alloréactifs à partir de leucocytes sanguins périphériques humains naïfs (PBL) qui répondent à des alloantigènes peptides-CMH connus (pMHC). Le protocole applique le marquage des multimères pMHC, l’enrichissement en billes magnétiques et la cytométrie en flux à des méthodes de culture in vitro de cellules uniques pour la génération de clones de lymphocytes T spécifiques de l’alloantigène. Cela permet d’étudier la biochimie et la fonction des lymphocytes T répondant à la stimulation allogénique.

Introduction

Les lymphocytes T sont des composantes essentielles du système immunitaire adaptatif. Les cellules T sont responsables de la médiation directement non seulement des réponses immunitaires protectrices à des agents pathogènes à travers une variété de mécanismes effecteurs, mais également le maintien activement auto-tolérance immunologique et diriger les réponses des autres cellules dans le système immunitaire. Ces fonctions sont dirigés à travers un certain nombre de signaux intégrés, y compris des récepteurs de cellule T (TCR) ligature, les cytokines et les chimiokines, et les métabolites ^1. Parmi ces signaux, le TCR est d'une importance particulière, c....

Protocol

NOTE: Ce protocole nécessite l'utilisation d'échantillons de sang périphérique chez des volontaires humains. Toutes les recherches sur des sujets humains doit être examiné et approuvé par un comité d'examen institutionnel études humaines pour assurer la conformité avec la Déclaration d'Helsinki (2013) et la Health Insurance Portability and Accountability Act de 1996.

1. Isolement de cellules de sang total T

1. Avant de commencer, chauffer le milieu à gradient de densité à la température ambiante. Aliquote de 4 ml de milieu de gradient de densité dans 2-4 stériles tubes de 15 ml à centrifuger coniques (1 tube sera u....

Results

Ce protocole décrit la génération de cultures de cellules T humaines clonale défini allo spécificité par un enrichissement par billes magnétiques et flux unicellulaire cytométrie tri stratégie. La figure 1 donne un aperçu du processus.

Figure 1: vue d'ensemble Protocole Le protocole décrit ici fournit une méthode fiable pour la production de clone.......

Discussion

L’alloréactivité des lymphocytes T est un phénomène étudié depuis longtemps et cliniquement pertinent. Les réponses prolifératives et effectrices robustes des lymphocytes T à la stimulation allogénique ont permis des analyses approfondies des réponses des lymphocytes T humains in vitro par le biais de réactions lymphocytaires mixtes relativement simples des lymphocytes T du sang périphérique contre des cellules allogéniques inactivées. Cependant, ces réponses primaires des lymphocytes T alloréactifs sont oligocl.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tube de prélèvement de sang veineux à l’héparine de sodium 16 x 100 mm	Becton, Dickenson and Company	366480
Lymphoprep	Stemcell Technologies	7801
Rosette Sep Kit d’enrichissement des cellules T humaines	Stemcell Technologies	15061
Dulbecco’s PBS, 1x sans Ca ou Mg	Corning	21-031-CV
Albumine	sérique bovineSigma-Aldrich	A7906
EDTA	Sigma-Aldrich	E6635
Tétramère pMHC marqué au fluorophore	NIH Tetramer Facility	NA
EasySep Kit de sélection de biotine	Stemcell Technologies	18553
EasySep Aimant	Stemcell Technologies	18000
TruStain FcX Human Fc solution	de blocageBiolegend	422301
Anti-CD5 PE-Cy7 (clone UCHT2)	Biolegend	300621
Anti-CD14 FITC (clone HCD14)	Biolegend	325603
Anti-CD19 FITC (clone HIB19)	Biolegend	302205
le DMEM d’Iscove, sans b-ME ni L-glutamine	Corning	15-016-CV
HEPES	Corning	25-060-CI
b-Mercaptoéthanol  ;	Life Technologies	21985-023
Glutamax	Life Technologies	35050061
Sulfate de gentamicine (50 mg/ml)	Omega Scientific	GT-50
Sérum AB humain, donneur masculin	Omega Scientific	HS-30
IL-2 humain recombinant	Peprotech	AF 200-02
Dynabeads T-Activateur humain CD3/CD28	Life Technologies	11131D
Milieu
Tampon
PBS, pH 7,4	1 L
BSA	10 g
EDTA (0,5 M)	2 ml
Milieu
DMEM d’Iscove	351,6 ml
Sérum AB humain inactivé par la chaleur	40 ml
HEPES (1 M)	4 ml
Glutamax (100x)	4 ml
Gentamicine (50 mg/ml)	0,4 ml
b-mercaptoéthanol (14,3 M)	1,4 ml
IL-2 humaine recombinante (1 mg/ml)	1 ml