TIRFM et GFP-sondes sensibles au pH pour l'évaluation des vésicules de neurotransmetteur Dynamics dans les cellules SH-SY5Y neuroblastome: imagerie cellulaire et analyse des données
Summary
This paper provides a method for investigating neurotransmitter vesicle dynamics in neuroblastoma cells, using a synaptobrevin2-pHluorin construct and Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy. The strategy developed for image processing and data analysis is also reported.
Abstract
Les vésicules synaptiques libèrent des neurotransmetteurs au niveau des synapses chimiques à travers un cycle dynamique de la fusion et la récupération. Suivi de l'activité synaptique en temps réel et disséquer les différentes étapes de exo-endocytose au niveau d'une seule vésicule sont cruciales pour comprendre les fonctions synaptiques dans la santé et la maladie.
Génétiquement codés sondes sensibles au pH visant directement les vésicules synaptiques et réflexion interne totale microscopie de fluorescence (TIRFM) fournissent la résolution spatio-temporelle nécessaire de suivre la dynamique de vésicules. Le champ évanescent généré par réflexion interne totale ne peut exciter des fluorophores placés dans une couche mince (<150 nm) au-dessus du couvercle de verre sur lequel les cellules adhèrent, exactement là où les processus de exo-endocytose ont lieu. Les images à contraste élevé qui en résultent sont parfaitement adaptés pour des vésicules suivi et l'analyse quantitative des événements de fusion.
Dans ce protocole, SH-SY5Y n humainecellules euroblastoma sont proposées comme un modèle précieux pour étudier la libération de neurotransmetteurs au niveau d'une seule vésicule par TIRFM, en raison de leur surface plane et la présence de vésicules dispersées. Les méthodes pour la culture de SH-SY5Y comme cellules adhérentes et pour leur transfection avec synapto-pHluorin sont fournis, ainsi que la technique pour effectuer l'imagerie et TIRFM. Enfin, une stratégie visant à sélectionner, compter et analyser les événements de fusion au niveau des cellules entières et unique vésicules est présenté.
Pour valider la procédure d'imagerie et l'analyse des données approche, la dynamique de vésicules pHluorin-marqués sont analysés en vertu de repos et stimulés (dépolarisants concentrations de potassium) conditions. Dépolarisation membranaire augmente la fréquence des événements de fusion et provoque une augmentation parallèle du signal de fluorescence nette enregistrée dans la cellule ensemble. Analyse d'un seul vésicules révèle modifications de comportement fusion-événement (hauteur accrue de pointe et la largeur). Ces données suggèrent eà la dépolarisation de potassium non seulement induit une libération de neurotransmetteurs massive, mais modifie également le mécanisme de la fusion des vésicules et le recyclage.
Avec la sonde fluorescente approprié, cette technique peut être utilisée dans différents systèmes cellulaires pour disséquer les mécanismes de sécrétion constitutive et stimulée.
Introduction
La transmission synaptique chimique entre les neurones est un mécanisme majeur de la communication dans le système nerveux. Elle se appuie sur la libération de neurotransmetteurs par un cycle dynamique de la fusion des vésicules et la récupération sur le site présynaptique. Un grand nombre de protéines impliquées dans la dynamique des vésicules ont été identifiés; Toutefois, leur contribution spécifique au phénomène reste à préciser une.
Notre compréhension est en partie limitée par le fait que les tests les plus largement utilisés pour exo / endocytose ne sont pas toujours les plus appropriées. Plusieurs études relatives à la fusion des vésicules et la dynamique reposent sur des techniques électrophysiologiques. Cette technique fournit une résolution temporelle optimale et est excellent pour enquêter sur la fusion initiale des vésicules à la membrane plasmique, mais est incapable de détecter la plupart des événements moléculaires sous-jacents qui soutiennent la fonction présynaptique. La microscopie électronique, de l'autre côté, fournit le meilleur morphological description de chaque étape singulière, mais l'aspect dynamique de l'événement ne peut pas être capturé, parce que les échantillons doivent être fixés de façon à être analysé.
L'avènement de nouvelles techniques d'enregistrement optique 2,3, en combinaison avec les progrès de la fluorescence des sondes moléculaires développement 4-6, permet la visualisation des processus d'exocytose dans les cellules vivantes, fournissant ainsi de nouveaux niveaux d'information sur la structure et la fonction synaptique.
Les premières études exploitées colorants dépendants de l'activité styryliques (FM1-43 et colorants organiques connexes) 7,8. State-of-the-art techniques d'imagerie utilisent des variantes sensibles au pH de la protéine fluorescente verte (GFP) (pHluorin) attaché à vésicules luminal protéines neuf. Ces sondes sont normalement désactivés lorsqu'ils sont présents dans les vésicules en raison du faible pH luminal. Après la fusion avec la membrane plasmatique, l'intérieur des vésicules est exposée à l'espace extracellulaire neutre, le pH brusquement augmente, soulage la trempe de protons dépend de pHluorin et le signal fluorescent apparaît rapidement. Comme la variation de pHluorin est plus rapide que l'événement de fusion, en contrôlant la fluorescence augmente, la fusion des vésicules avec la membrane peut être mesurée et analysée. Étant donné que les molécules d'pHluorin surface sont marqués endocytose, le signal de fluorescence retourne ensuite au niveau de base, par conséquent la même construction peut également être utilisée pour contrôler le recyclage des vésicules 9.
Bien que le capteur de pH des vésicules à marquage assure uniquement la visualisation de ces vésicules qui fusionnent vraiment avec la membrane plasmique, l'imagerie à résolution spatiale et temporelle élevée est nécessaire de décrire en détail les étapes intervenant dans les processus d'endocytose exo /. La technique optique qui fournit la résolution spatio-temporelle est nécessaire microscopie de réflexion totale interne de fluorescence (TIRFM), une demande de 10 microscopie à fluorescence.
"> La réflexion interne totale se produit à l'interface entre le verre lamelle et l'échantillon. Lorsque le trajet de la lumière atteint la lamelle de avec un angle d'incidence supérieur à l'angle critique, la lumière d'excitation ne est pas transmise dans l'échantillon, mais est complètement réfléchie. Dans ces conditions, un évanescentes formes d'onde de la lumière à l'interface et se propage dans le milieu avec moins de densité optique (l'échantillon). Comme l'intensité du champ évanescent décroît exponentiellement avec la distance de l'interface (avec une profondeur de pénétration environ 100 nm) que les fluorophores à proximité la plus proche de la lamelle couvre-objet peut être excité, tandis que ceux plus éloignés de la limite sont pas. Dans les cellules transfectées avec GFP-assemblage, cette profondeur correspond à des protéines exprimés sur la membrane plasmique ou dans des structures vésiculaires approcher. Comme fluorophores dans l'intérieur de la cellule ne peuvent pas être excités, la fluorescence de fond est minimisée, et une image avec un signal très élevé / fond ratio est formée 11.Plusieurs caractéristiques font TIRFM la technique de choix pour la surveillance de la dynamique des vésicules. Le contraste parfait et le rapport signal-bruit ratio élevé permettent la détection de très faibles signaux découlant de vésicules simples. acquisition d'image à base de puce dans chaque trame fournit la résolution temporelle nécessaire pour détecter des processus hautement dynamiques. Enfin, l'exposition minimal de cellules à la lumière à tout autre plan dans l'échantillon réduit fortement phototoxicité et permet l'enregistrement longue durée time-lapse 12.
L'analyse des données reste l'aspect le plus difficile et crucial de cette technique. La façon la plus simple de contrôler la fusion des vésicules est de mesurer l'accumulation de protéines fluorescentes reporter à la surface de la cellule, au fil du temps 13. Comme fusion augmente, le signal de fluorescence augmente ainsi nettes. Cependant, cette méthode peut sous-estimer le processus, en particulier dans les grandes cellules et dans des conditions de repos,parce que les processus d'endocytose et photoblanchiment compensé l'augmentation de l'intensité de fluorescence due à la vésicule exocytose. Une autre méthode consiste à suivre chaque événement de fusion unique 14. Cette dernière méthode est très sensible et peut révéler des détails importants sur les mécanismes de fusion. Cependant, il nécessite la sélection manuelle des événements uniques, parce que les procédures à suivre complètement automatisés vésicules et d'enregistrer la fluctuation de leurs signaux fluorescents sont pas toujours disponibles. L'observation de la dynamique des vésicules nécessite cellules d'échantillonnage à haute fréquence. Cela génère une grande quantité de données qui peuvent difficilement être analysée manuellement.
La proposition de ce document est d'optimiser la technique d'imagerie de TIRFM de surveillance de la base et la libération de neurotransmetteurs stimulée dans la lignée de cellules de neuroblastome SH-5YSY, et de décrire, étape par étape, une procédure développée dans le laboratoire pour analyser les données, à la fois à des niveaux de cellules entières et unique vésicules.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cet article présente un protocole à l'image et à analyser la dynamique des vésicules dans les cellules sécrétant, utilisant des vecteurs et TIRFM ADNc codé fluorescentes. Les éléments clés de l'imagerie par TIRFM succès sont la sélection du modèle cellulaire et transfection de cellules avec des indicateurs optiques génétiquement codés de la libération des vésicules et le recyclage.
TIRFM est idéal pour la croissance des cellules adhérentes à un couvercle de verre…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à remercier l'Università degli Studi di Milano pour le soutien aux Eliana Di Cairano (post-doctorat) et Stefania Moretti (Ph.D. bourse). Ce travail a été soutenu par le Programme de recherche de l'Université PUR CP
Nous tenons à remercier le professeur Jeremy M. Henley, École de biochimie, Université de Bristol, Royaume-Uni, pour la pHluorin construire et le Dr Francesco Dotti d'assistance dans l'analyse de données, et Silvia Marsicano pour l'assistance technique.
Materials
| Equipment | ||||
| Axio Observer Z1 | Zeiss | 491912-9850-000 | inverted microscope http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/products/light-microscopes/axio-observer-for-biology.html#introduction |
|
| Multiline Argon Laser Lasos 77 | Lasos | 00000-1312-752 | multi-line (458/488/514 nm), 100mW argon-ion laser http://www.lasos.com/products/argon-ion-laser |
|
| Laser TIRF slider | Zeiss | 423681-9901-000 | http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/products/imaging-systems/single-molecular-imaging-laser-tirf-3.html | |
| 100x Objective | Zeiss | 421190-9900-000 | Oil, NA 1.45 Alpha-Plan https://www.micro-shop.zeiss.com/?l=en&p=us&f=o&a=v&m=a&id=421 190-9900-000&ss=1 |
|
| CCD Camera RetigaSRV Fast 1394 | QImaging | http://www.qimaging.com/products/datasheets/Retiga-SRV.pdf | ||
| LAMBDA 10-3 optical filter changer with SmartShutter | Sutter Instrument Company | http://www.sutter.com/IMAGING/lambda103.html | ||
| Software | ||||
| Image ProPlus 6.3 Software | Media Cybernetics | spot selection, ROI selection, fluorescence intensity determination http://www.mediacy.com/index.aspx?page=IPP |
||
| Excel | Microsoft | photobleaching correction, whole-cell and single-vesicle analyses http://office.microsoft.com/it-it/excel/ |
||
| GraphPad Prism 4.00 | GraphPad Software, Inc. | statistical analysis http://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ |
References
- Sudhof, T. C. The synaptic vesicle cycle. Annu. Rev. Neurosci. 27, 509-547 (1146).
- Denk, W., Svoboda, K. Photon upmanship: why multiphoton imaging is more than a gimmick. Neuron. 18 (3), 351-357 (1997).
- Helmchen, F., Svoboda, K., Denk, W., Tank, D. W. In vivo dendritic calcium dynamics in deep-layer cortical pyramidal neurons. Nat Neurosci. 2 (11), 989-996 (1999).
- Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annu Rev Biochem. 67, 509-544 (1998).
- Matz, M. V., et al. Fluorescent proteins from non bioluminescent Anthozoa species. Nat Biotechnol. 17 (10), 969-9673 (1999).
- Ribchester, R. R., Mao, F., Betz, W. J. Optical measurements of activity-dependent membrane recycling in motor nerve terminals of mammalian skeletal muscle. Proc Biol Sci. 255 (1342), 61-66 (1994).
- Polo-Parada, L., Bose, C. M., Landmesser, L. T. Alterations in transmission, vesicle dynamics, and transmitter release machinery at NCAM-deficient neuromuscular junctions. Neuron. 32 (5), 815-828 (2001).
- Gaffield, M. A., Betz, W. J. Imaging synaptic vesicle exocytosis and endocytosis with FM dyes. Nat Protoc. 1 (6), 2916-2921 (2006).
- Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
- Axelrod, D. Total internal reflection fluorescence microscopy. Methods Cell. Biol. 89, 169-221 (2008).
- Sankaranarayanan, S., De Angelis, D., Rothman, J. E., Ryan, T. A. The Use of pHluorins for Optical Measurements of Presynaptic Activity. Biophys. J. 79, 2199-2208 (2000).
- Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist. J. Cell Sci. 123, 3621-3628 (2010).
- Wyatt, R. M. Balice-Gordon R.J. Heterogeneity in Synaptic Vesicle Release at Neuromuscular Synapses of Mice Expressing SynaptopHluorin. J. Neurosci. 28 (1), 325-335 (2008).
- Tsuboi, T., Rutter, G. A. Multiple forms of "kiss-and-run" exocytosis revealed by evanescent wave microscopy. Curr Biol. 13, 563-567 (2003).
- Miloso, M., et al. Retinoic Acid-Induced Neuritogenesis of Human Neuroblastoma SH-SY5Y Cells Is ERK Independent and PKC Dependent. J. Neurosci. Res. 75, 241-252 (2004).
- Jaskolski, F., Mayo-Martin, B., Jane, D., Henley, J. M. Dynamin-dependent Membrane Drift Recruits AMPA Receptors to Dendritic Spines. J Biol Chem. 284 (18), 12491-12503 (2009).
- Treccani, G., et al. Stress and corticosterone rapidly increase the readily releasable pool of glutamate vesicles in synaptic terminals of prefrontal and frontal cortex. Mol Psychiatry. 19 (4), 433-443 (1038).
- D’Amico, A., et al. The surface density of the glutamate transporter EAAC1 is controlled by interactions with PDZK1 and AP2 adaptor complexes. Traffic. 11 (11), 1455-1470 (2010).
- Perego, C., Di Cairano, E. S., Ballabio, M., Magnaghi, V. Neurosteroid allopregnanolone regulates EAAC1-mediated glutamate uptake and triggers actin changes in Schwann cells. J Cell Physiol. 227 (4), 1740-1751 (2012).
- Bergeron, A., Pucci, L., Bezzi, P., Regazzi, R. Analysis of synaptic-like microvesicles exocytosis of B-cells using a live imaging technique. PlosOne. 9, e87758 (2014).
- Encinas, M., et al. Sequential treatment of SH-Sy5Y cells with retinoic acid and brain-derived neurotrophic factor gives rise to fully differentiated, neutrophic factor-dependent, human neuron-like cells. J. Neurochem. 75 (3), 991-1003 (2000).
- Kume, T., et al. Dibutyryl cyclic AMP induces differentiation of human neuroblastoma SH-SY5Y cells into a noradrenergic phenotype. Neurosci Lett. 443 (3), 199-203 (2008).
- Diaspro, A., Chirico, G., Usai, C., Ramoino, P., Dobrucki, J., Pawley, J. B. Photobleaching. Handbook of Biological Confocal Microscopy. , 690-699 (2006).
- Rossano, A. J., Chouhan, A. K., Macleod, G. M. Genetically encoded pH-indicators reveal activity-dependent cytosolic acidification of Drosophila motor nerve termini in vivo. J Physiol. 591 (7), 1691-1706 (2013).
