Ricostituzione di una proteina transmembrana, la tensione gated canali ionici, KvAP, in Giant unilamellari vescicole per la microscopia e Patch Clamp Studies
Summary
La ricostituzione della proteina transmembrana, KvAP, in giganti vescicole unilamellari (GUVs) è dimostrato per due metodi di disidratazione, reidratazione – electroformation, e gonfiore gel assistita. In entrambi i metodi, piccole vescicole unilamellari contenenti la proteina sono fusi insieme per formare GUVs che possono poi essere studiate mediante microscopia a fluorescenza e patch-clamp elettrofisiologia.
Abstract
Giant unilamellari vescicole (GUVs) sono un popolare sistema biomimetico per studiare membrana fenomeni associati. Tuttavia, comunemente usato protocolli di crescere GUVs devono essere modificati in modo da formare GUVs contenenti proteine transmembrana funzionali. Questo articolo descrive due metodi disidratazione-reidratazione – electroformation e gonfiore gel assistita – per formare GUVs contenenti il canale del potassio voltaggio-dipendenti, KvAP. In entrambi i metodi, una soluzione di piccole vescicole unilamellari contenenti proteine è parzialmente disidratato per formare una pila di membrane, che viene poi lasciata rigonfiare in un buffer reidratazione. Per il metodo electroformation, il film si deposita sugli elettrodi di platino in modo che un campo AC può essere applicato durante pellicola reidratazione. Al contrario, il metodo gonfiore gel assistita utilizza un substrato gel di agarosio per migliorare pellicola reidratazione. Entrambi i metodi possono produrre GUVs in (ad esempio, 100 mm) concentrazioni basse (ad esempio, 5 mm) e fisiologici di sale. I GUVs risultanti sono caratterizzati tramite microscopia a fluorescenza, e la funzione di canali ricostituiti misurate utilizzando la configurazione patch-clamp dentro-fuori. Mentre rigonfiamento in presenza di un campo elettrico alternato (electroformation) fornisce un alto rendimento di GUVs esenti da difetti, il metodo gonfiore gel assistita produce una distribuzione più omogenea della proteina e non richiede attrezzature speciali.
Introduction
Quando si studiano i principi fisici che governano i sistemi viventi, approcci bottom-up permettono uno sperimentatore di controllare la composizione del sistema e altri parametri che non sono facilmente manipolabili in sistemi basati su celle 1. Per i processi basati membrana, Giant unilamellari vescicole (GUVs, diametro ~ 1-100 micron) hanno dimostrato di essere un sistema molto utile biomimetico 2-7 in quanto sono adatti per gli studi di microscopia e micromanipolazione 8-10. Mentre ci sono molti protocolli diversi per produrre GUVs, la maggior parte rientrano in due categorie – emulsione a base avvicina 11,12 e tecniche basate su reidratante un film lipidico 13-16. Nei metodi basati emulsione, i volantini interni ed esterni delle membrane GUV sono assemblati sequenzialmente da monostrati lipidici alle interfacce acqua / olio. Questo approccio è ideale per incapsulare proteine solubili connei GUVs, e per formare GUVs con asimmetrico composizione lipidica volantino. Tuttavia, GUVs formati da emulsioni possono conservano tracce di solvente che modificano le proprietà meccaniche della membrana 17, e l'approccio non è particolarmente adatto a trans-membrana proteica ricostituzione.
Metodi reidratazione Film basano sul fatto che l'essiccazione (disidratazione) provoca molti miscele lipidiche a formare una pila multi-lamellare membrane. Se questo stack viene poi messo in contatto con un tampone acquoso, membrane della pila si sposteranno flussi a parte come solventi tra loro e sulla superficie della pila, singoli membrane possono staccarsi per formare GUVs 13,18 (così un vero e proprio zoo altri oggetti lipidiche). Tuttavia, anche per il tampone e lipidi composizioni ottimali, questo classico metodo di "gonfiore spontaneo" ha una relativamente bassa resa di GUVs prive di difetti. Un metodo ampiamente utilizzato per aumentare la resa di GUVs privi di difetti è "electroformation221 ;, in cui si applica un campo di corrente alternata (AC) durante pellicola reidratazione. Mentre il meccanismo resta poco conosciuto, "electroformation" può dare rendimenti GUV spettacolari (> 90% in circostanze favorevoli) per i buffer di concentrazione bassa di sale (<5 mm) 14,19, e può anche lavorare in tamponi fisiologici (~ 100 mm) con una frequenza più alta (500 Hz versus 10 Hz) campo AC e elettrodi di platino 15. Un approccio alternativo per aumentare la resa di GUVs senza difetti è "gel assistita rigonfiamento", in cui la soluzione lipidica viene depositato su un substrato di gel polimerico piuttosto che passiva (ad esempio, di vetro, PTFE) substrati usati in classica "gonfiore spontanea ". Quando il film lipidico / gel risultante viene reidratato, GUVs possono rapidamente formare anche per i buffer fisiologici 16,20.
Tutti questi metodi possono produrre solo GUVs lipidi che possono essere utilizzati per studiare membrana associata fenomeni come lainterazione tra proteine solubili e le membrane. Tuttavia, a includere una proteina trans-membrana nella GUVs, sono necessarie modifiche significative per garantire che la proteina rimane in uno stato funzionale durante la procedura di ricostituzione. Mentre le soluzioni di lipidi in solventi organici (ad esempio, cloroformio, cicloesano) sono ideali per la produzione di film lipidici, proteine transmembrana sono tipicamente stabile solo quando la loro idrofoba dominio trans-membrana viene incorporato in un doppio strato lipidico, o circondato da una micella detergente ( ad esempio, durante la purificazione della proteina). Così, il materiale di partenza per una ricostituzione è tipicamente membrane native, proteina purificata in una soluzione detergente, o piccole vescicole contenenti proteine unilamellari (Proteo-SUV) e / o vescicole multi-lamellari (Proteo-MLV) formate da rimozione del detersivo nel presenza di lipidi. La maggior parte dei metodi per incorporare queste proteine di membrana in GUVs rientrano in tre categorie.
Diretta insertion: proteine transmembrana sospeso nel detergente viene mescolato con preformati, lipidi-solo, GUVs solubilizzate leggermente detergenti, e il detersivo poi rimosso utilizzando biobeads 21. Mentre concettualmente semplice, questo metodo richiede un controllo preciso della concentrazione di detersivo, come troppo alta concentrazione di detersivo può sciogliere i GUVs mentre una concentrazione troppo bassa può causare la proteina di dispiegarsi o aggregata.
GUV / Proteo-SUV Fusion: Proteine in Proteo-SUV è combinato con preformati, lipidi soli GUVs e la fusione è facilitata con particolari peptidi fusogeniche 22 o detersivo 21. In genere il grado di fusione è limited portando a GUVs a bassa densità di proteine.
Disidratazione / reidratazione: Un film lipidico contenente proteine è formata mediante disidratazione parziale di un proteo-SUV (o Proteo-MLV) e soluzione GUVs vengono poi coltivata come un film lipidico pura. La sfida è ovvio per proteggere la proteina durante la dehydrati parzialiil passo 23, ma il metodo è stato utilizzato con successo per la ricostituzione delle proteine trans-membrana, come batteriorodopsina, calcio-ATPasi, integrina e VDAC in GUVs 7,23 – 25.
Questo articolo descrive i protocolli disidratazione / reidratazione per rendere GUVs contenenti il canale del potassio voltaggio-dipendenti, KvAP, dalla iper-termofila Archaea, Aeropyrum PERNIX. KvAP ha un alto grado di omologia con i canali del potassio voltaggio dipendenti eucariotiche 26 e una struttura cristallina nota 27 , il che rende un buon modello per studiare il meccanismo di tensione gating. Produzione di Proteo-SUV è stato descritto nel dettaglio in precedenza e non è parte di questo tutorial 26,28,29. È importante sottolineare che, KvAP Proteo-SUV non devono essere prodotte per ogni preparazione GUV, in quanto possono essere memorizzati in piccoli (ad esempio, 10 ml) aliquote a -80 ° C per lunghi periodi di tempo (> 1 anno). Electroformationo gonfiore gel assistita può quindi essere utilizzato per far crescere GUVs dalle KvAP Proteo-SUV (o Proteo-MLV).
I passi fondamentali per il protocollo electroformation sono illustrati nella Figura 1. Goccioline di una soluzione di SUV contenenti la proteina si depositano sui fili di platino (mostrati nella Figura 2). Disidratazione parziale della sospensione SUV porta alla formazione di un film lipidico proteine mediante la fusione di SUV. Durante reidratazione, un campo AC viene applicata agli elettrodi per aiutare gli strati lipidici delaminazione e formare GUVs. Un campo 10 Hz funziona bene quando si usa "basso contenuto di sale" (<5 mm) buffer di reidratazione 28 e GUVs richiedere diverse ore a crescere. Al contrario, i buffer fisiologici (contenente ~ 100 mM sale) lavorare bene con una tensione più bassa, 500 Hz campo AC ma richiedono un prolungato (~ 12 ore) gonfiore periodo 15. Questo metodo si basa su un protocollo precedente utilizzando ITO vetrini 24, ma utilizza una camera di cont personalizzatoaining due fili di platino, come illustrato nella figura 2 (vedi la discussione per i dettagli di design e suggerimenti per semplificare, camere improvvisato).
La figura 3 illustra il metodo di soffiatura gel assistita. Il protocollo funziona bene con tamponi con concentrazioni saline fisiologiche, è rapido, e produce GUVs con una distribuzione più omogenea della proteina. Tuttavia, il rendimento di isolati, GUVs apparentemente difetto liberi (cioè, la membrana GUV è uniforme a lunghezza-righe ottiche e non racchiude oggetti) è inferiore, anche se fornisce un numero sufficiente di patch-clamp ed esperimenti micro-manipolazione . Questo metodo è basato su un protocollo utilizzando gel di agarosio per produrre solo lipidi GUVs 16 e richiede attrezzature meno specializzata rispetto al metodo electroformation.
La caratterizzazione dei GUVs con microscopia a fluorescenza è descritto, così come procedure utilizzando uno standard patch-clamp set-up dimisurare l'attività KvAP in "inside-out" escisse patch di membrana.
Growing GUVs contenenti proteine può essere più difficile che GUVs solo lipidi. In particolare, la resa finale può dipendere GUV sensibilmente esattamente come la soluzione SUV viene deposto e disidratato per formare la pila membrana. Per qualcuno senza alcuna precedente esperienza con GUVs, può essere utile a crescere prima GUVs solo lipidi seguendo un protocollo convenzionale 15,16 in cui il film membrana è formata depositando lipidi da un solvente organico. Una volta che il protocollo tradizionale funziona bene, SUV deposizione e disidratazione parziale possono essere masterizzati utilizzando SUV solo lipidi, che sono anche molto utile quando si regola il protocollo per una nuova composizione lipidica. Quando GUVs crescono in modo affidabile da SUV solo lipidi, è quindi solo un piccolo passo per la produzione di proteine contenenti GUVs da Proteo-SUV.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sistemi modello biomimetici sono uno strumento importante per lo studio delle proprietà e le interazioni delle proteine e delle membrane. Rispetto ad altri sistemi ricostituiti come BLM o membrane lipidiche supportati, GUV sistemi basati presenti diverse opportunità anche notevole controllo della composizione di membrana, la tensione e la geometria, oltre ad essere veramente senza olio. Tuttavia, incorporando proteine transmembrana, come KvAP, in GUVs richiede adeguamenti significativi di protocolli conven…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Susanne Fenz for discussing the possibility of reconstituting proteins by agarose swelling, Feng Ching Tsai for current measurements, and present and former members of the Bassereau group for support and assistance. The project was funded by the Agence Nationale de la Recherche (grant BLAN-0057-01), by the European Commission (NoE SoftComp), by the Université Pierre et Marie Curie (grant from the FED21, Dynamique des Systèmes Complexes). M.G. was supported by an Institut Curie International PhD Fellowship, S.A. by a fellowship from the Fondation pour la Recherche Médicale, G.E.S.T. by a Marie Curie Incoming International Fellowship from the European Commission and a grant from the Université Pierre et Marie Curie. The publication fees were covered by the Labex ‘CelTisPhyBio’ (ANR-11-LABX0038).
Materials
| Name of the Material/Equipment |
Company | Catalog Number | Comments/ Description |
| DPhPC (1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine) | Avanti Polar Lipids | 850356P | |
| Egg PC L-α-phosphatidylcholine (Egg, Chicken) | Avanti Polar Lipids | 840051P | |
| Egg PA L-α-phosphatidic acid (Egg, Chicken) | Avanti Polar Lipids | 840101P | |
| 18:1 (Δ9-Cis) PC (DOPC) 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | 850375P | |
| cholesterol (ovine wool, >98%) | Avanti Polar Lipids | 700000P | |
| TRed-DHPE | Invirtogen | T-1395MP | labeled lipid |
| BPTR-Ceramide | Invirtogen | D-7540 | labeled lipid |
| Choloroform | VWR | 22711.290 | AnalaR Normapur |
| Acetone | VWR | 20066.296 | AnalaR Normapur |
| Ethanol | VWR | 20821.330 | AnalaR Normapur |
| Kimwipe | Kimtech | 7552 | |
| Hamilton syringes | Hamilton Bonaduz AG | diverse | |
| Amber vials and teflon cups | Sigma | SU860083 and SU860076 | |
| Parafilm | VWR | 291-1214 | |
| microcentrifuge tube | eppendorf | diverse | |
| Agarose | Euromex | LM3 (1670-B, Tg 25.7C, Tm 64C) | |
| Sucrose | Sigma | 84097-1kg | |
| Glucose | Sigma | G8270-1kg | |
| Trehalose | Sigma | T9531-25G | |
| KCl | Sigma | P9333-1kg | |
| Hepes | Sigma | H3375-100G | |
| TRIS | Euromex | EU0011-A | |
| Osmometer | Wescor | Vapro | |
| pH meter | Schott instruments | Lab850 | |
| Sonicator | Elmasonic | S 180 H | |
| Syringe filter 0.2µm | Sartorius steim | Minisart 16532 | |
| Function generator | TTi | TG315 | |
| Platinum wires | Goodfellow | LS413074 | 99.99+%, d=0.5mm |
| Polytetrafluoroethylene | Goodfellow | ||
| Dow Corning 'high vacuum grease' | VWR | 1597418 | |
| sealing paste | Vitrex medical A/S, Denmark | REF 140014 | Sigillum Wax |
| Cover slides 22×40 mm No1,5 | VWR | 631-0136 | |
| Cover slides 22×22 mm No1,5 | VWR | 631-0125 | |
| plasma cleaner | Harrick | PDC-32G | airplasma, setting 'high' |
| petri dishes | Falcon BD | REF 353001 | 3.5 cmx1cm |
| patch clamp amplifier | Axon instruments | Multiclamp700B | |
| DAQ Card | National Instruments | PCI-6221 | |
| Labview | National Instruments | version 8.6 | |
| Glass pipettes boro silicate OD 1mm ID 0.58mm | Harvard Apparatus | GC100-15 | |
| Electrode holder | Warner Instruments | Q45W-T10P | |
| Micromanipulator | Sutter | MP-285 | |
| pipette puller | Sutter | P-2000 | |
| Camera | ProSilica | GC1380 | |
| Zeiss microscope | Zeiss | Axiovert 135 | |
| Objective | Zeiss | 40x long working distance, Phase contrast | |
| Objective | Zeiss | 100x Plan-Apochromat NA 1.3 | |
| Filterset GFP (for Alexa-488) | Horiba | XF100-3 | |
| Filterset Cy3 (for TexasRed) | Horiba | XF101-2 | |
| beta-casein | Sigma | C6905-1G | |
| confocal microscope | Nikon Eclipse TE 2000-E | D-Eclipse C1 confocal head | |
| Objective | Nikon | Plan Fluor 100× NA1.3 | |
| matlab | Mathworks | for image processing and analysis of the current traces |
References
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