Metodo semplice per DNA fluorescenza<em> In Situ</em> Ibridazione di cromosomi Squashed
Summary
Here, we present a simple method for performing fluorescence DNA in situ hybridization (DNA ISH) to visualize repetitive heterochromatic sequences on slide-mounted chromosomes. The method requires minimal reagents and it is versatile for use with short or long probes, different tissues, and detection with fluorescence or non-fluorescence-based signals.
Abstract
DNA ibridazione in situ (ISH DNA) è un metodo comunemente utilizzato per le sequenze di mappatura a specifiche regioni cromosomiche. Questo approccio è particolarmente efficace per la mappatura delle sequenze altamente ripetitive alle regioni eterocromatiche, dove approcci computazionali affrontare sfide proibitive. Qui si descrive un protocollo semplificato per ISH DNA che aggira lavaggi formammide che sono passi standard in altri protocolli ISH DNA. Il nostro protocollo è ottimizzato per l'ibridazione con brevi singole sonde filamento di DNA che portano coloranti fluorescenti, che segnano in modo efficace le sequenze di DNA ripetute all'interno di regioni cromosomiche eterocromatiche tutta una serie di diversi tipi di tessuto insetto. Tuttavia, le applicazioni possono essere estese da usare con sonde più grandi e la visualizzazione di sequenze singola copia (non ripetitivi) DNA. Dimostriamo questo metodo mappando diverse sequenze ripetitive diversi di cromosomi schiacciate da Drosophila melanogaster cellule neurali e Nasoniavitripennis spermatociti. Mostriamo modelli di ibridazione sia per le piccole, le sonde sintetizzati commercialmente e per una sonda più grande per il confronto. Questa procedura utilizza semplici forniture di laboratorio e reagenti, ed è ideale per gli investigatori che hanno poca esperienza con l'esecuzione di ISH DNA.
Introduction
DNA ibridazione in situ (ISH DNA) è un metodo comunemente utilizzato per le sequenze di mappatura a specifiche regioni cromosomiche. Sonde alle regioni a copia singola all'interno euchromatin possono essere generati attraverso una manciata di approcci, tra cui nick-traduzione o end-etichettatura dei prodotti lunghi di DNA 1,2 e l'incorporazione di deoxygenin (DIG) nucleotidi -attached e il loro riconoscimento attraverso una grande varietà di anticorpi gruppo-coniugato 1-3. Visualizzazione di sequenze eucromatiche in pochi o solo numero copia richiede l'uso di singole, grandi sonde ad alta attività specifica o un cocktail di più, sonde minori che aumentano insieme il segnale.
Al contrario, le sequenze altamente ripetitive trovano in heterochromatin, come DNA satellite, sono bersagli facili per ISH DNA perché normalmente esistono come decine di migliaia di ripetizioni raggruppati in regioni cromosomiche singole note come blocchi. Elementi trasponibili possono anche esseretrovata ad alti numeri di copia presso distinto cromosomica loci 2. In questi casi, singole sonde con bassa attività specifica può effettivamente etichettare sequenze eterocromatiche a causa della loro ibridazione in più siti. Sonde a sequenze ripetitive possono essere sintetizzati oligonucleotidi commercialmente come brevi (30-50 bp) e coniugati chimicamente con qualsiasi più gruppi fluorescenti differenti. Mappatura sequenze ripetitive all'interno heterochromatin utilizzando le tecnologie di sequenziamento del genoma-è difficile a causa di problemi incontrati in impalcature edili all'interno di blocchi satellitari altamente ripetitive 4-6,7. Attualmente, ISH si pone come il modo più efficace di mappare queste sequenze a livello sub-cromosoma. Questa strategia è importante per la mappatura gran numero di sequenze ripetitive che vengono scoperte da studi del genoma e del trascrittoma di sequenziamento in corso.
L'efficienza e la facilità di mappatura sequenze ripetute sui cromosomi montati scorrevoli sarebbero Greatly rafforzata da un protocollo semplificato per ISH DNA. Per esempio, i protocolli esistenti per ISH DNA coinvolgono diversi lavaggi di tessuti ibridizzati in soluzione formammide 2,8, aggiungendo così sostanzialmente il tempo necessario per le sequenze di mappatura e produrre anche grandi quantità di rifiuti chimici per questa costosa reagente. Qui si descrive un metodo di revisione ISH DNA che aggira la necessità di lavaggi formammide e utilizza attrezzature di laboratorio di base e reagenti. Questo metodo è stato originariamente progettato per la rapida mappatura altamente ripetitive sequenze di DNA in regioni eterocromatiche di neuroblasti larvali Drosophila utilizzando oligonucleotidi sintetizzati in commercio che coniugate con coloranti fluorescenti. Tuttavia, questo metodo funziona anche per la mappatura sequenze ripetute utilizzando sonde grandi sintetizzati attraverso altri mezzi e 9,10 per diversi tipi di tessuto e cromosomi diversi. Inoltre, questo metodo può essere utilizzato per mappare le sequenze eucromatiche utilizzando più o multiple sonde brevi all'interno della sequenza euchromatic di interesse.
Protocol
Representative Results
Discussion
ISH DNA è spesso utilizzato per mappare le sequenze specifiche per i cromosomi. Abbiamo descritto un metodo semplice per ISH DNA ottimizzato per alto numero di copie, sequenze eterocromatiche. Invece di utilizzare lavaggi in una soluzione di formammide, che è un requisito in altri protocolli ISH DNA esistenti, poniamo vetrini montati tissutale direttamente su un blocco di pre-riscaldata per denaturare il DNA. Questo metodo aggira l'uso di grandi quantità di formammide. Un passo fondamentale per la produzione di s…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Zhaohua Irene Tang in the W. M. Keck Science Department for the use of her epifluorescence microscope and the Werren lab for donating Nasonia for dissections. This work was supported in part by an NIH-NRSA fellowship (5F32GM105317-02) to AML.
Materials
| Company | |
| Materials | |
| Poly-L-lysine coated slides (regular slides also can be used) | Sigma Aldrich |
| Ultrafine tweezers (5 gauge) | Dumont |
| 22mmx22mm cover slips, Sigmacote-treated by immersion for 15 seconds, blotting dry, and wiping away all traces of Sigmacote so that cover slip is clear | Fisher |
| Sigmacote | Sigma |
| Filter paper (75-150mm) | |
| Paraffin wax paper | |
| Heat block with thermometer | |
| Dry incubator | |
| Razor blades | |
| Humidity chamber (empty pipette tip box or Tupperware, lined with moistened paper towels or Kimwipes) | |
| Coplin jars (with slide grooves) | |
| Aluminum foil | |
| Pasteur pipettes | |
| 1.5 mL microfuge tubes | |
| Nail polish (clear or colored) | |
| 2-20 μL micropipette and plastic tips | |
| 20-25 standard metal paperclips linked to form a chain | |
| Company/Notes | |
| Reagents | |
| 16% EM grade paraformaldehyde | Electron Microscopy Reagents |
| Acetic acid | Sigma |
| Liquid nitrogen | |
| 100% Ethanol, chemical grade | |
| Commercially synthesized, fluorescently labeled oligos | |
| Long biotinylated probe (e.g. nick translated and biotinylated with BioNick from Invitrogen) | Invitrogen; Alternative steps 2.7.1-2.7.3 |
| Rhodamine-Avidin (for detection of long biotinylated probe) | Roche; Alternative steps 2.7.1-2.7.3 |
| Hybridization buffer | Recipe below |
| 4X SSCT (Saline-sodium citrate + Tween) | Recipe below |
| 0.1X SSC (Saline-sodium citrate) | Recipe below |
| Blocking solution | Recipe below |
| SBT (SSC, Bovine serum albumin, Tween) | Recipe below |
| 1X PBT (Phosphate-buffered saline + Tween) | Recipe below |
| 1X PBS (Phosphate-buffered saline) | |
| Hypotonic solution (0.5% sodium citrate in H2O) | |
| Formamide | Sigma Aldrich |
| Vectashield mounting medium with DAPI | Vector laboratories |
References
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